Dieses 3D-Cokultur-Sphäroidsystem wurde entwickelt, um physiologische Angiogenese nachzuahmen. Es wird wirksam sein, um potenzielle angiogene Modulatoren zu bewerten und liefert vorher im Vorfeld von In-vivo-Studien vorhersehbare Informationen. Dieses System nutzt Co-Kultur-Sphäroide, die von zwei vaskulären Vorläuferzellen gebildet werden und kann verwendet werden, um zelluläre Wechselwirkungen, Keimung und die tubuläre Reifung der physiologischen Angiogenese zu untersuchen.

Wenn wir Patientenzellen verwenden können, um Co-Kultur-Sphäroide zu bilden, können wir dieses System verwenden, um personalisierte Behandlungen für abnormale Angiogenese-bedingte Krankheiten wie Krebs zu entwickeln. Dieses Assay-System kann die Empfindlichkeit und Effizienz von Studien der Angiogenese und der Arzneimittelentwicklung erhöhen. Beginnen Sie mit 05%trypsin-EDTA, um EFCCs und MSCs für drei bzw. fünf Minuten in einem Zellkultur-Inkubator von 80 bis 90 % konfluenten Zellkulturen zu trennen.

Inaktivieren Sie Trypsin mit frischem kompletten DMEM-Medium, und pipette die Zellen ein paar Mal, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, gefolgt von zwei Washes mit serumfreiem Medium. Nach der zweiten Wäsche die EFCKw auf dreimal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter mittlerer Konzentration und die MSCs auf zwei mal 10 bis sechs Zellen pro Millimeter mittlerer Konzentration in einzelnen Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren verdünnen.

Pellet die Zellen durch Zentrifugation, und sorgfältig aspirieren alle bis auf die letzten 15 bis 25 Mikroliter Überstand aus jeder Zellprobe. Als nächstes setzen Sie jedes Pellet in 250 Mikroliter Verdünnungsmittel C aus einem fluoreszierenden Farbstoff-Kit wieder auf und pipettedien die Zellsuspensionen sanft, um eine vollständige Dispersion zu gewährleisten. 250 Mikroliter frisch zubereitetes 20-Mikromolar PKH67 in die Röhre von EFCCs geben.

Fügen Sie 250 Mikroliter 12-Mikromolar PKH26 in das Rohr von MSCs. Mischen Sie sofort beide Zellsuspensionen. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur mit Schütteln, vor Licht geschützt, stoppen Sie den Färbevorgang mit einer einminütigen Inkubation in 0,5 Milliliter FBS pro Tube.

Am Ende der Inkubation, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, und sorgfältig entfernen Sie den Überstand, gefolgt von zwei Wäschen in zwei Milliliter frisches komplettes Medium pro Wäsche. Dann hängen die Zellen in dem jeweiligen Medium in 15-Milliliter-Röhren. Zur Sphäroiderzeugung, nach der zweiten Wäsche, zuerst verdünnen Sie die Zellsuspensionen in der entsprechenden Konzentration des Endothelialezellwachstumsmediums MV2, ergänzt mit 20%Methylcelluloselösung und 5%fetaler Rinderserumkonzentration.

Als nächstes fügen Sie jede Zellsuspension in ein sterilisiertes rechteckiges Polystyrol-Reservoir. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um etwa 125-Mikroliter-Zelltröpfchen auf die Abdeckung einer 150-Millimeter-Kulturplatte zu geben. Wenn alle Zellen hinzugefügt wurden, invertieren Sie die Abdeckung über dem Boden einer Schale, die 15 Milliliter PBS enthält, und legen Sie die Platten 24 Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator.

Am nächsten Tag spülen Sie die Tellerabdeckungen mit fünf Milliliterpbs in eine 50-Milliliter-Röhre pro Schale. Spülen Sie die Abdeckungen mit weiteren fünf MilliliterPBS, um alle verbleibenden Sphäroide zu sammeln, und pellet die Sphäroide durch Zentrifugation. Alle bis auf die letzten 100 bis 200 Mikroliter Überstand vorsichtig entsorgen und vorsichtig auf die Rohrwand tippen, so dass die Sphäroide im restlichen Überstand frei aufgehängt werden.

Fügen Sie das entsprechende Volumen des Endothelialezellwachstumsmediums MV2 hinzu, das mit 5% fetalem Rinderserum und 40% Methylcelluloselösung zu jeder Röhre ergänzt wird, um die Sphäroide bei 100 Sphäroiden pro Milliliter mittlerer Konzentration wieder auszusetzen. Verwenden Sie eine ein Milliliter Pipette Spitze geschnitten auf einen Durchmesser von drei bis fünf Millimetern, um die Sphäroid-Aufhängungen sanft zu mischen. Verwenden Sie eine neue Breitspitzen-1-Milliliter-Pipette, um die Sphäroid-Suspensionslösung mit einem neutralisierten Kollagengel Typ I im Eins-zu-Eins-Verhältnis auf Eis zu mischen.

Fügen Sie 900 Mikroliter jeder sphäroid-suspendierenden Kollagengellösung in die Brunnen einer vorgewärmten 24-Well-Platte ein. Lassen Sie die Suspensionen 30 Minuten im Zellkultur-Inkubator polymerisieren, bevor Sie die Sphäroide mit 100 Mikrolitern Endothelzellwachstumsmedium MV2 abdecken, ergänzt mit 2,5%FBS und 50 Nanogramm pro Milliliter VEGF zu den ECFC-only Sphäroiden und Medium, das nur zu den MSC- und ECFC-plus-MSC-Sphäroidkulturen ergänzt wird. Legen Sie dann jede Platte in einen Echtzeit-Zellrecorder, der in einem Zellkultur-Inkubator installiert ist, und konzentrieren Sie sich nach dem Zufallsprinzip auf fünf bis zehn Sphäroide bei einer 10-fachen Vergrößerung, um die keimende Bildung jedes fluoreszenzbeschriftten Sphäroids stündlich für 24 Stunden zu überwachen.

Um das Sphäroid-Sprossen zu quantifizieren, importieren Sie die Bilddateien in ImageJ, und messen Sie die Anzahl und Länge der Sprossen, die das entsprechende Fluoreszenzsignal von fünf zufällig ausgewählten Sphäroiden pro experimenteller Gruppe ausdrücken. Bei ECFC-plus-MSC-Sphäroiden sind die Anzahl der Sprossen und die kumulative Sprossenlänge im Vergleich zu den ECFC-nur-Sphäroiden zu allen Zeitpunkten deutlich höher. Nur MSCs-Sphäroide bilden keine Sprossen, sondern zeigen eine individuelle Migration des MSC außerhalb von Sphäroiden.

Die Kennzeichnung von ECFC mit grünfluoreszierendem Farbstoff und MSC mit Rotfluoreszenzfarbstoff vor der Kombination zur Erzeugung von ECFC-plus-MSC-Sphäroiden zeigt, dass ECFC-vermittelte Sprossenstrukturen mit MSCs abgedeckt sind, was darauf hindeutet, dass kombinierte MSCs während der Sprossenbildung als perivaskuläre Zellen fungieren, was die Stabilität und Haltbarkeit des Sprosens durch die enge Verbindung zwischen zwei Gefäßzellen verbessert. ECFC-plus-MSC-Sphäroide, die mit einem Angiogenese-Inhibitor vorbehandelt wurden, weisen eine verringerte Sprossenzahl und eine kumulative Sprossenlänge in dosisabhängiger Weise auf, verglichen mit der Kontrolle von ECFC-plus-MSC-Sphäroiden. In parallelen Experimenten zeigen ECFC-only Spheroide, die mit dem Inhibitor vorbehandelt werden, gefolgt von stimulation mit VEGF, ebenfalls eine verringerte Wachstumsfaktor-induzierte Sprossenzahl und kumulative Sprossenlänge auf dosisabhängige Weise.

Bemerkenswert ist, dass eine höhere Konzentration von Angiogenese-Hemmern erforderlich ist, um ECFC-plus-MSC-Sphäroide im Vergleich zu NUR ECFC-Sphäroiden zu hemmen. Das Tumorwachstum wird bei hochdosierten Angiogenese-Hemmer-behandelten Tieren im Vergleich zu kontrollbehandelten Tieren und niedrig dosierten Angiogenese-Hemmer-behandelten Tieren in einem menschlichen Xenograft-Tumor-Mausmodell signifikant gehemmt. Die Plasmakonzentration von Bevacizumab bei hochdosierten Mäusen betrug 568 plus oder minus 40,62 Mikrogramm pro Milliliter, was näher am IC50-Wert von Bevacizumab lag, um die kumulative Sprossenlänge in ECFC-plus-MSC-Sphäroiden anstelle von ECFC-nur Sphäroiden zu hemmen.

Dies deutet darauf hin, dass das CO-Kultur-Sphäroidsystem ECFC-plus-MSC für die Vorhersage effektiver Plasmakonzentrationen im Vorfeld einer Tierstudie geeignet ist. Die Verwendung einer breit-spitzen, ein-ml Pipetten, um die Sphäroide sanft zu mischen, während sie in Kollagengel auf Eis sind, ist wichtig für den Schutz der Integrität der Sphäroide. Wir können dieses System ändern, um andere Zelltypen wie Immunzellen und andere extrazelluläre Matrizen einzuführen, um Zellmatrix-Crosstalk während der Angiogenese zu untersuchen.