我们的协议描述了一种构建 RA 模型的方法。其成功率超过93%，其发病机制取决于T细胞、B细胞和先天免疫，这使得研究人员能够从全球免疫角度更好地研究RA的发病机制。然后，我们使用具有免疫调节作用的 INKT 细胞进行治疗。
INKT细胞通过体内引入对治疗效果良好，为 INKT 细胞的临床应用提供基础数据支持，真正具有 INKT 细胞的临床应用价值。该技术的最大优点是操作简单，易于复制。演示程序将是陈胜德，高翔和张景南，研究生从我实验室。
首先，重达 1.75 毫克的 HGPI325 至 339 和 HGPI469 至 483 片段，并将它们溶解在 5.25 毫升 4 摄氏度的三蒸馏水中。在 50 摄氏度的水浴中溶解完全弗伦德的辅助剂。将 5.25 毫升的离心管中再抽出 5.25 毫升，冷却以使用。
将HG6PI溶液和全弗伦德佐剂溶液的混合物放入人工乳化装置中，并连接两个玻璃注射器。在冰浴中，以每分钟十到二十次的恒定速度和频率推动注射器，以完全乳化混合物肽溶液，并完成Freund的辅助剂溶液。然后，将乳液液滴保持在水中十分钟。
接下来，将乳化的HG6PI的150微升注入小鼠的尾根皮下。立即和48小时后，注射200毫克百日咳毒素到小鼠内腹。现在，注射正常的DBA1小鼠内没有高斯瑟在剂量0.1毫克每公斤体重。
建模三天后，麻醉后，分离小鼠的脾脏。通过切割和研磨脾脏在 200 网筛中，准备单个细胞悬架。用 PBS 清洗电池悬浮液。
在200倍g下离心5分钟，然后丢弃上一代。用一毫升全血组织溶液重新悬浮细胞。加入三毫升小鼠淋巴细胞分离介质。
然后在室温下以300倍g离心20分钟。为了净化 INKT 细胞，将 10 个 10 微升的 4 摄氏度 PBS 重新向第七细胞中，加入 10 微升装装 CD1 四面体 PE，并在 4 摄氏度下在黑暗中孵育 15 分钟。用 PBS 清洗细胞两次，并在 80 微升 PBS 中重新暂停。
加入20微升的抗PE微珠，在4摄氏度下孵育20分钟。用 PBS 清洗两次，用 500 微升 PBS 重新暂停细胞。将分拣柱放在 MACS 分拣机的磁场中，然后用 500 微升 PBS 冲洗。
将准备好的单元格悬浮液添加到分拣列中，收集流通过，然后用 PBS 缓冲液冲洗三次。移除磁场，将 PBS 缓冲液添加到分拣列中。以恒定压力快速推动柱塞，将标记的电池推入收集管。
并获得纯化的 INKT 细胞。使用自动单元格计数器计数。要识别 INKT 细胞表型，首先，从纯化的 INKT 细胞中向第六细胞服用 1 倍十倍，并在 50 微升 PBS 中重新发送。
在单一正向控制管中加入0.5微升的α高瑟PE CD1四分之一，或10微升的菲特克TCRβ。添加 0.5 微升的 α 高斯珀 PE CD1 四分之一，在样品管中加入 10 微升 FITC TCR 测试版。在黑暗中在摄氏四度下孵育三十分钟。
之后，在PBS中清洗细胞，然后以200倍g离心5分钟。丢弃上经剂，加入一毫升FoxP3固定渗透工作溶液。在黑暗中4摄氏度下孵育细胞45分钟。
然后，加入1倍渗透工作溶液1毫升，在室温下以500倍g离心细胞5分钟。丢弃上一杯。添加一个亚历克萨弗尔647小鼠抗 PLZF 的微升和 PerCP Cy5.5 小鼠抗 Tbet 的微升，在黑暗中的室温下孵育 30 分钟。
接下来，添加两个微升渗透缓冲液工作溶液，并在200倍g下离心，进行5分钟的清洁。丢弃上一杯。将细胞重新在500微升PBS中，通过流式细胞测量。
本研究与对照组相比，RA模型组脚趾在建模后开始出现红肿，并逐渐加重。14天后，脚踝关节的红色肿胀达到峰值，随后逐渐缓解。病理结果表明，RA模型小鼠脚踝突触组织中炎症细胞的渗透程度不同。
峰值炎症发生在建模后的第 14 天。在RA模型组中，亲炎细胞因子的血清水平在建模后11天和14天显著增加。而抗炎细胞因子显著减少。
这一数字表明，正常小鼠的 INKT2 速率约为 5%。在体内诱导后，INK2的速率约为82%。MACS 纯化后，INK2 的速率超过 92%。
在这里，我们展示一种乳化我们在RA中看到的主要多肽的方法。乳化液滴在水中保存10分钟。结果正在分散。此协议是治疗RA引发的特殊NKT细胞的新附加程序。
可应用于细胞免疫治疗或其他自身免疫性疾病和肿瘤。该模型可刺激RA患者CD4 T细胞和NKT细胞缺陷的整体增殖，为RA免疫通路深入研究奠定了基础。在此协议中，百日咳毒素在建模过程中通过间向注射。
请穿实验服和一次性手套。并携带所有操作标准，以防止刺伤感染。
