このプロトコルは RA モデルを構築する方法を記述しています。その成功率は93%を超えており、その病因はT細胞、B細胞、および先天性免疫に依存し、研究者は世界的な免疫の観点からRAの病因をよりよく研究することを可能にする。その後、免疫調節効果を有するINKT細胞を治療に使用します。
INKT細胞は、INKT細胞の臨床応用に基本的なデータサポートを提供し、INKT細胞の臨床応用価値を真に爆発させるin vivo導入による治療に良い効果を有する。この技術の最大の利点は、操作が簡単でコピーが簡単であるということです。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生である陳勝大、高翔、張景南です。
まず、HGPI325〜339とHGPI469〜483の断片の両方の1.75ミリグラムの重量を量り、摂氏4度の3重蒸留水の5.25ミリリットルに溶解します。フルフロイントアジュバントを摂氏50度の水浴に溶かします。別の10ミリリットルの遠心分離管に5.25ミリリットルを引き込み、使用するために冷却します。
HG6PI溶液と完全なフロイントのアジュバント溶液の混合物を、2つのガラス注射器を接続した人工乳化ユニットに入れます。氷浴では、シリンジを1分間に10~20回一定の速度と周波数で押し込み、混合物ペプチド溶液を完全に乳化し、フロイントのアジュバント溶液を完全に乳化させます。その後、エマルジョン液滴を水中に10分間保管します。
次に、乳化したHG6PIの150マイクロリットルをマウスの尾根皮下に注入する。すぐに48時間後に, マウスの内腹腔内に百日性毒素の200ミリグラムを注入.さて, 通常の DBA1 マウスの体内でガウザーなしでイントラインペリン体体重のキログラムあたり 0.1 ミリグラムの投与量.
モデリングの3日後、麻酔後、マウスの脾臓を分離する。200メッシュふるいで脾臓を切断し、粉砕することにより、単一のセル懸濁液を準備します。細胞懸濁液をPBSで洗浄する。
200回gで5分間遠心分離機を出し、上清を捨てる。全血組織溶液の1ミリリットルで細胞を再中断します。マウスリンパ球分離培地を3ミリリットル加える。
そして、室温で300倍gで20分間細胞を遠心分離する。INKT細胞を精製するには、摂氏4度PBSの100マイクロリットルで7番目の細胞に10を再懸濁し、アルファガウサーを搭載したCD1四量体PEを10マイクロリットル加え、暗闇の中で摂氏4度でインキュベートします。PBSで細胞を2回洗浄し、80マイクロリットルのPBSで再懸濁します。
20マイクロリットルの抗PEマイクロビーズを加え、暗闇の中で摂氏4度で20分間インキュベートします。PBSでそれらを2回洗浄し、PBSの500マイクロリットルで細胞を再中断します。選別カラムを MACS ソーターの磁界に入れ、500 マイクロリットルの PBS でリンスします。
準備した細胞懸濁液をソートカラムに加え、流れを通して収集し、PBSバッファーで3回リンスします。磁界を取り除き、ソートカラムにPBSバッファを1ミリリットル加えます。一定の圧力でプランジャーを素早く押し込み、ラベル付きセルを回収管に入れます。
精製したINKT細胞を得る。自動セル カウンターでカウントします。INKT細胞表現型を同定するために、まず、精製されたINKT細胞から6番目の細胞に10回10回服用し、50マイクロリットルのPBSで再懸濁する。
アルファガウスPE CD1テトラマー0.5マイクロリットル、またはFITC TCRベータの10マイクロリットルを単一の正の対照管に加えます。0.5マイクロリットルのアルファガウサーPE CD1テトラマーを加え、FITC TCRベータを10マイクロリットルのFITC TCRベータをサンプルチューブに加えます。暗闇の中で30分間摂氏4度でインキュベートする。
その後、PBSで細胞を洗浄し、200回gで遠心分離機を5分間洗浄します。上清を捨て、FoxP3固定パーメアビライゼーション作業溶液の1ミリリットルを追加します。そして、暗闇の中で摂氏4度で45分間細胞をインキュベートします。
次いで、1x透過性ワーキング溶液の1ミリリットルを加え、室温で500倍gの細胞を5分間遠心分離する。上清を捨てます。AlexaFluor 647マウスアンチPLZFの1マイクロリットルとPerCP Cy5.5マウス抗Tbetの1マイクロリットルを追加し、暗闇の中で室温で30分間インキュベートします。
次に、2マイクロリットルのパーメビライゼーションバッファー作業溶液と遠心分離機を200回gに加え、5分間洗浄します。上清を捨てます。細胞を500マイクロリットルのPBSで再懸濁し、フローサイトメトリーで測定する。
本研究では、対照群と比較して、RAモデル群のつま先が徐々に悪化してモデル化した後に赤い腫れを示し始めた。14日で、足首関節の赤い腫れがピークに達し、続いて徐々に軽減した。病理的な結果は、RAモデルマウスの足首滑膜組織における炎症細胞の浸潤度が異なる段階で異なっていたことを示す。
ピーク炎症は14日目のポストモデリングで起こった。RAモデル群では、炎症促進サイトカインの血清レベルは、モデリング後11日および14日後に有意に増加した。抗炎症性サイトカインは有意に減少した。
この図は、正常マウスにおけるINKT2の割合が約5%であったことを示す。インビボ誘導後のインク2の割合は約82%であった。INK2の割合は、MACS精製後の92%以上であった。
ここでは、RAに見られる主要なポリペプチドを乳化する方法を示す。乳化液滴を10分間水中に保管する。結果が分散している。このプロトコルは、RAの上げられた特別なNKT細胞の治療のための新しいアドオンです。
これは、細胞免疫療法または他の自己免疫疾患および腫瘍に適用することができる。このモデルは、RA患者におけるCD4 T細胞およびNKT細胞の欠損の全体的な増殖を刺激することができ、これはRA免疫経路の深い研究の基礎となる。このプロトコルでは、ペルタシス毒素は、モデリング中に間腹腔内に注入される。
実験服と使い捨て手袋を着用してください。そして、刺し傷感染症を防ぐために、操作のすべての基準を運ぶ。
