Protokolümüz bir RA modeli oluşturmak için bir yöntem açıklar. Başarı oranı yüzde 93'ün üzerindedir ve patogenezi T hücrelerine, B hücrelerine ve doğuştan gelen bağışıklığa bağlıdır, bu da araştırmacıların RA patogenezini küresel immün perspektiften daha iyi incelemelerine olanak sağlar. Daha sonra tedavi için immünomodülatör etkileri olan INKT hücreleri kullanırız.
INKT hücreleri INKT hücrelerinin klinik uygulaması için temel veri desteği sağlayan ve INKT hücrelerinin klinik uygulama değerini gerçekten patlatan in vivo giriş ile tedavi üzerinde iyi bir etkiye sahiptir. Bu teknolojinin en büyük avantajı, kullanımı kolay ve kolay kopyalama olmasıdır. Prosedürü gösteren Chen Shengde, Gao Xiang ve Zhang Jingnan, benim laboratuvar dan yüksek lisans öğrencisi olacaktır.
Başlamak için, hem HGPI325 339 ve HGPI469 483 parçaları 1,75 miligram ağırlığında ve 4 santigrat derece üçlü distile su 5,25 mililitre onları eritin. Komple Freund'un Adjuvan'ına 50 derecelik su banyosunda çözün. Başka bir 10 mililitre santrifüj tüp içine 5,25 mililitre çizin ve kullanım için soğutun.
HG6PI çözeltisi ve Komple Freund'un Adjuvan çözeltisinin karışımını iki cam şırıngalı yapay bir emülsifikasyon ünitesine bağlayın. Bir buz banyosunda, karışımı peptid çözeltisini tamamen emülsifiye etmek ve Freund'un Adjuvan çözeltisini tamamlamak için şırıngayı dakikada on ila yirmi kez sabit bir hız ve frekansta itin. Daha sonra emülsiyon damlacıklarını 10 dakika suda bekletin.
Daha sonra, farenin kuyruk köküne 150 mikrolitre emülsifiye HG6PI enjekte edin. Hemen ve 48 saat sonra, fare intraperineally içine 200 miligram pertussis toksin enjekte. Şimdi, vücut ağırlığının kilogram başına 0.1 miligram dozajında gausser olmadan intraperineally normal DBA1 fare enjekte.
Modellemeden üç gün sonra, anesteziden sonra farenin dalağını izole edin. 200 örgü elekteki dalağını kesip öğüterek tek bir hücreli süspansiyon hazırlayın. Hücre süspansiyonuna PBS ile yıkayın.
Santrifüj 200 kez g beş dakika ve supernatant atın. Bir mililitre tam kan dokusu çözeltisi ile hücreleri tekrar askıya alın. Fare lenfosit ayırma orta üç mililitre ekleyin.
Ve sonra oda sıcaklığında 300 kez g 20 dakika boyunca hücreleri santrifüj. INKT hücrelerini arındırmak için, 10'uncu hücrelere 4 derece lik PBS'lik 100 mikrolitre ile yeniden askıya alın, 10 mikrolitre alfa gausser yüklü CD1 tetramer PE ekleyin ve karanlıkta on beş dakika boyunca 4 derece santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve 80 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın.
Anti-PE mikroboncuklar 20 mikrolitre ekleyin ve karanlıkta yirmi dakika boyunca dört santigrat derece onları kuluçka. PBS ile iki kez yıkayın ve PBS 500 mikrolitre ile hücreleri yeniden askıya. Sıralama sütununu MACS ayırıcısının manyetik alanına yerleştirin ve 500 mikrolitre PBS ile durulayın.
Hazırlanan hücre süspansiyonuna sıralama sütununa ekleyin, akışı toplayın ve PBS arabelleğiyle üç kez durulayın. Manyetik alanı kaldırın ve sıralama sütununa bir mililitre PBS arabelleği ekleyin. Etiketli hücreleri toplama tüpüne doğru itmek için sürekli bir basınçta pistonu hızlıca itin.
Ve saflaştırılmış INKT hücrelerini elde edin. Otomatik bir hücre sayacı ile say. INKT hücre fenotipini tanımlamak için, ilk olarak, saflaştırılmış INKT hücrelerinden altıncı hücrelere bir kere on alın ve 50 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın.
Tek pozitif kontrol tüpüne 0,5 mikrolitre alfa gausser PE CD1 tetramer veya 10 mikrolitre FITC TCR beta ekleyin. Alfa gausser PE CD1 tetramer 0,5 mikrolitre ekleyin, örnek tüp fitc TCR beta 10 mikrolitre ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yat.
Bundan sonra, PBS hücreleri yıkayın ve daha sonra santrifüj 200 kez g beş dakika. Supernatant atın ve FoxP3 fiksasyon permeabilization çalışma çözümü bir mililitre ekleyin. Ve hücreleri karanlıkta 45 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, 1x permeabilizasyon çalışma çözeltisi bir mililitre ekleyin ve beş dakika oda sıcaklığında 500 kez g hücreleri santrifüj. Supernatant atın. AlexaFluor 647 fare anti-PLZF bir mikrolitre ve PerCP Cy5.5 fare anti-Tbet bir mikrolitre ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında otuz dakika kuluçka.
Daha sonra, temizlik için beş dakika boyunca 200 kez g permeabilizasyon tampon çalışma çözeltisi ve santrifüj iki mikrolitre ekleyin. Supernatant atın. PBS 500 mikrolitre hücreleri resuspend ve akış sitometri ile ölçmek.
Bu çalışmada, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, RA model grubunun ayak başları yavaş yavaş şiddetlenme ile modelleme sonra kırmızı şişlik göstermeye başladı. 14 gün, ayak bileği ekleminde kırmızı şişlik kademeli rahatlama izledi zirve yaptı. Patolojik sonuçlar, RA model farelerin ayak bileği sinovyal dokusundaki inflamatuar hücrelerin infiltrasyon derecesinin farklı aşamalarda farklı olduğunu göstermektedir.
Pik inflamasyon gün 14 post modelleme oluştu. RA model grubunda pro-inflamatuar sitokinlerin serum düzeyleri modellemeden 11 gün ve 14 gün sonra anlamlı olarak artmıştır. Anti-inflamatuar sitokinler önemli ölçüde azalırken.
Bu rakam normal farelerde INKT2 oranının yüzde beş civarında olduğunu göstermektedir. INVivo indüksiyondan sonra INK2 oranı yaklaşık yüzde 82 idi. MACS arınma sonra INK2 oranı yüzde 92'den fazla oldu.
Burada RA'da gördüğümüz majör polipeptide emülgatifi yapmak için bir yöntem gösteriyoruz. Emülsifiye damlacıklar 10 dakika suda bekletilir. Sonuçlar dağılıyor. Bu protokol RA özel NKT hücrelerinin tedavisi için yeni bir eklentidir.
Hangi hücre immünoterapi veya diğer otoimmün hastalık ve tümörler doğru uygulanabilir. Bu model RA hastalarında CD4 T hücreleri ve NKT hücrelerinin genel çoğalmasını teşvik edebilir, RA bağışıklık yollarının derinlemesine çalışma için temel oluşturur. Bu protokolde, pertussis toksin modelleme sırasında interperitoneally enjekte edilir.
Lütfen deneysel kıyafetler ve tek kullanımlık eldivenler giyin. Ve bıçak yarası bir enfeksiyon önlemek için operasyon tüm standartları taşımak.
