يمكن استخدام بروتوكول زرع نخاع العظم الجديد هذا للتحقيق في كيفية تنظيم الخلايا الجذعية المضيفة استجابات الكسب غير المشروع مقابل المضيف والكسب غير الطعم مقابل سرطان الدم بعد الزرع. السابقين خلايا الجسم الحي تجديد يسمح هذا البروتوكول أن تتكيف لاختبار دور السكان الخلايا المناعية الأخرى مثل الضامة والعدلات ببساطة عن طريق تعديل حالة الثقافة. إظهار الإجراء معي سيكون مدير المختبر كريستال هوساك والجامعة الجامعية سانجيف Gurshaney.
بالنسبة للمتبرعين T-cell المنضب C57BL/6 إعداد نخاع العظام، حصاد عظم الفخذ والساق وفقا للبروتوكولات القياسية من الفئران المانحة القتل الرحيم ونقل العظام في طبق بيتري قطره 92 ملليمتر يحتوي على 1٪ 1 في الدقيقة 1 المتوسطة. باستخدام مقص، وإزالة نهايات من كل العظام وملء حقنة ثلاثة ملليلتر مجهزة إبرة قياس 26 مع 1٪ 1٪ 1 متوسطة. أدخل الإبرة في نهاية واحدة من العظام والاكتئاب المكبس لطرد نخاع العظم من تجويف و في مصفاة خلية جمع.
عندما تم جمع كل من نخاع العظام, سلالة قطع نخاع العظام من خلال مرشح شبكة 75 ميكرومتر ونقل تعليق خلية واحدة في أنبوب جديد 50 ملليلتر. رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 20 مرات 10 إلى الخلايا الستة لكل ملليلتر تركيز في برنامج تلفزيوني تكملها 0.5٪ BSA. بعد ذلك، أضف 0.05 ميكروغرام من الأجسام المضادة THI1 لكل مرة واحدة 10 مرات إلى الخلايا الست لاحتضان لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مرتين مع 10 ملليلتر من الثلج البارد PBS و resuspend بيليه في مرتين 10 إلى الخلايا السبع لكل ملليلتر التركيز في 0.5٪ BSA تكمل مع 10٪ الأرانب الشباب تكملة و 2٪ DNAse في الماء المعقم لاحتضان 45 دقيقة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مرتين مع 15 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الطازجة في غسل وإعادة تثبيت بيليه في 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.5٪ BSA. تجمع الغدد الليمفاوية والطحال في مصفاة المسام 40 ميكرومتر واستخدام المكبس حقنة لmacerate الأنسجة من خلال المرشحات لإطلاق الخلايا.
غسل المصفاة والمغطس مع متوسط RPMI تكملها 1٪ FBS لجمع كل من الخلايا ورواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إضافة خمسة ملليلترات من ACK lysis العازلة إلى بيليه الخلية. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ووقف رد الفعل مع خمسة ملليلتر من المتوسطة تكمل مع 1٪ FBS و بيليه خلايا الدم البيضاء عن طريق الطرد المركزي.
Resuspend بيليه في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت MACS لحساب وتمييع الخلايا إلى تركيز مرتين 10 إلى الخلايا الثماني لكل ملليلتر في عازلة MACS جديدة. إضافة التركيز المناسب من الأجسام المضادة للكرئي، المضادة للمحظورات، المضادة لخلايا، المضادة لخلايا، ومضادة لخلايا NK-الخلايا المضادة للاستنفاد في مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لاحتضان لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مع 10 ملليلتر من الجليد الباردة MACS العازلة وإعادة تثبيت بيليه في مرة واحدة 10 إلى الخلايا ثمانية في تركيز مليلتر في عازلة ماك جديدة.
بعد ذلك، أضف 0.22 ميكرولترات من مضادات البيوتين MicroBeads لكل مرة واحدة 10 مرات إلى الخلايا الست مع الاختلاط لاحتضان لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مع 10 ملليلتر من الجليد الباردة MACS العازلة وجمع الخلايا التائية المخصب غير منضم عن طريق فصل الخرز المغناطيسي باستخدام فاصل MACSxpress وفقا لبروتوكولات عزل حبة القياسية. في نهاية الفصل، رواسب الخلايا التائية عن طريق الطرد المركزي وإعادة تثبيت بيليه في خمسة ملليلتر من عازلة MACS جديدة للعد.
لتوليد الخلايا التشعبية المشتقة من نخاع العظام ، قم بعزل نخاع العظم من عظم الفخذ من النوع البري أو فئران الضربة القاضية العامل B كما هو موضح وتحلل خلايا الدم الحمراء في خمسة ملليلترات من ACK تحلل العازلة ، ووقف التفاعل مع 10 ملليلتر من RPMI تستكمل بنسبة 1 ٪ FBS بعد خمس دقائق. بعد جمع خلايا الدم كلها عن طريق الطرد المركزي، resuspend بيليه في 10 ملليلتر من متوسطة الثقافة إلى مرتين 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر التركيز وإضافة 20 نانوغرام لكل ملليلتر من GM-CSF إلى الخلايا قبل بذر 10 ملليلتر من الخلايا على الفردية 100 من 15 ملليمتر أطباق بيتري في 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة ستة أيام. في اليوم السادس، قم بتنشيط ثقافات الخلايا المتسخة المشتقة من نخاع العظم مع 25 ميكروغرام لكل ملليلتر من LPS لكل لوحة.
على الأقل 85٪ من خلايا نخاع العظام المستزرعة تفرق إلى خلايا تشعبية. نقاء T-cell بعد إثراء الخرز المغناطيسي هو 90٪ ويتطابق نموذج MHC الرئيسي غير المتطابق C57BL/6 BALB/c مع تطور GVHD بعد الزرع. ذروة شدة يحدث ما يقرب من 11 يوما بعد نقل الخلايا تليها انخفاض في الدرجات السريرية واستعادة وزن الجسم حتى اليوم 16.
استسلم المستفيدون بشكل موحد إلى GVHD من قبل 30 إلى 40 يوما بعد الزراعة. ومن المثير للاهتمام، زرع مع عامل B خروج المغلوب الخلايا المتجرف يحسن البقاء على قيد الحياة المتلقي وعشرات السريرية GVHD. Luciferase-transe التي تسببها A20 B-الخلايا الليمفاوية يسمح رصد نمو الورم في الحيوانات الحية.
في هذه التجربة التمثيلية ، توفي جميع متلقي النوع البري BALB / c الذين تلقوا نخاع العظم وحده بالإضافة إلى A20 من انتكاس الورم. توفي المتلقين من النوع البري BALB / c المزروعة مع الخلايا التائية المانحة المستخلصة من نخاع العظم من GVHD. بالإضافة إلى ذلك، الحيوانات التي تلقت نخاع العظام المانحة والخلايا التائية المنضب ACC1 توفي من كل من GVHD والانتكاس الورم.
لتوليد ما يكفي من خلايا نخاع العظام، يجب أن تكون عظام الساق وعظم الفخذ التي تم جمعها خالية تماما من أنسجة العضلات قبل تصحيح نخاع العظم. يمكن التنقية السلبية لخلايا نخاع العظام مع biotinylase المضادة لـ CD3 ومضاد Biotin MicroBeads أيضا في إجراء لنضوب الخلايا الليمفاوية من نخاع العظام.
