Este novo protocolo de transplante de medula óssea pode ser usado para investigar como as células dendríticas hospedeiras regulam as respostas de enxerto versus hospedeiro e enxerto versus leucemia após o transplante. As regenerações celulares ex vivo permitem que este protocolo seja adaptado para testar o papel de outras células imunes, como macrófagos e neutrófilos simplesmente modificando a condição cultural. Demonstrando o procedimento comigo estarão a gerente de laboratório Krystal Hossack e a graduanda Sanjeev Gurshaney.
Para o doador, a preparação da medula óssea C57BL/6, colhe o fêmur e a tíbia de acordo com os protocolos padrão de camundongos doadores eutanizados e transfira os ossos para uma placa petri de 92 milímetros de diâmetro contendo meio 1%RPMI. Com uma tesoura, remova as extremidades de cada osso e encha uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de calibre 26 com meio RPMI fresco de 1%.. Insira a agulha em uma extremidade de um osso e deprimir o êmbolo para tirar a medula óssea da cavidade e em um coador de células de coleta.
Quando toda a medula óssea tiver sido coletada, coe as peças da medula óssea através de um filtro de malha de 75 micrômetros e transfira a suspensão unicelular para um novo tubo de 50 mililitros. Sedimentar as células por centrifugação e resuspensar a pelota em 20 vezes 10 para as seis células por concentração de mililitro em PBS suplementada com 0,5%BSA. Em seguida, adicione 0,05 microgramas de anticorpo THI1 por um vezes 10 às seis células para uma incubação de 30 minutos a quatro graus Celsius.
No final da incubação, lave as células duas vezes com 10 mililitros de PBS gelado e resuspenque a pelota em duas vezes 10 às sete células por concentração de mililitro em 0,5%BSA complementada com complemento de coelho 10% jovem e 2%DNAse em água estéril para uma incubação de 45 minutos a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, lave as células duas vezes com 15 mililitros de PBS fresco por lavagem e resuspenha a pelota em 20 mililitros de PBS contendo 0,5% de BSA. Acumule os linfonodos e o baço em um filtro de poros de 40 micrômetros e use um êmbolo de seringa para macerar os tecidos através dos filtros para liberar as células.
Lave o coador e o êmbolo com meio RPMI suplementado com 1%FBS para coletar todas as células e sedimentar as células por centrifugação. Adicione cinco mililitros de tampão de lise ACK à pelota celular. Após cinco minutos em temperatura ambiente, pare a reação com cinco mililitros de médio suplementado com 1%FBS e pelota os glóbulos brancos por centrifugação.
Resuspenda a pelota em cinco mililitros de tampão MACS para contagem e diluir as células para uma concentração de duas vezes 10 para as oito células por mililitro em tampão MACS fresco. Adicione a concentração apropriada de anticorpos anti-eritrócitos, anti-granulocitos, anti-células B e anticorpos anti-NK-nk-plotion de esgotamento por uma vez 10 às seis células para uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave as células com 10 mililitros de tampão MACS frio e resuspenja a pelota em uma única vez 10 para as oito células por concentração mililitro em tampão MACS fresco.
Em seguida, adicione 0,22 microliters de MicroEsferas Anti-Biotina por uma vezes 10 às seis células com mistura para uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave as células com 10 mililitros de tampão MACS frio gelado e colete as células T enriquecidas sem limites por separação de contas magnéticas usando separador MACSxpress de acordo com protocolos padrão de isolamento de contas. No final da separação, sedimente as células T por centrifugação e resuspenda a pelota em cinco mililitros de tampão MACS fresco para contar.
Para gerar células dendríticas derivadas da medula óssea, isole a medula óssea dos fêmures do tipo selvagem ou dos camundongos de knockout fator B como demonstrado e lise os glóbulos vermelhos em cinco mililitros de tampão de lise ACK, interrompendo a reação com 10 mililitros de RPMI complementados com 1% de FBS após cinco minutos. Depois de coletar as células sanguíneas inteiras por centrifugação, resuspengue a pelota em 10 mililitros de cultura média a duas vezes 10 a 6 células por concentração de mililitro e adicione 20 nanogramas por mililitro de GM-CSF às células antes de semear 10 mililitros de células em placas de Petri individuais de 15 milímetros a 37 graus e 5% de dióxido de carbono por seis dias. No sexto dia, ative as culturas celulares dendríticas derivadas da medula óssea com 25 microgramas por mililitro de LPS por placa.
Pelo menos 85% das células de medula óssea cultivadas se diferenciam em células dendríticas. A pureza das células T após o enriquecimento de contas magnéticas é de 90%O principal modelo de MHC incompatível C57BL/6 BALB/c corresponde intimamente ao desenvolvimento de GVHD após o transplante. O pico de gravidade ocorre aproximadamente 11 dias após a transferência celular, seguido de redução nos escores clínicos e recuperação do peso corporal até o dia 16.
Os destinatários sucumbiram uniformemente ao GVHD por 30 a 40 dias após a transferência. Curiosamente, o transplante com células dendríticas de choque fator B melhora a sobrevivência do receptor e os escores clínicos de GVHD. O linfoma de células A20 B transduzidas pela luciferase permite o monitoramento do crescimento do tumor em animais vivos.
Neste experimento representativo, todos os receptores balb/c do tipo selvagem que receberam medula óssea sozinhos mais A20 morreram de uma recaída tumoral. Receptores balb/c do tipo selvagem transplantados com células T de doadores derivados da medula óssea morreram de GVHD. Além disso, animais que receberam medula óssea doadora e células T empobrecidas por ACC1 morreram de GVHD e recaída tumoral.
Para gerar células de medula óssea suficientes, os ossos coletados da tíbia e do fêmur devem estar completamente livres de tecido muscular antes da correção da medula óssea. A purificação negativa das células de medula óssea com biotinilase anti-CD3 e MicroEsferas Anti-Biotina também pode ser realizada para esgotar o linfócito da medula óssea.
