严格厌氧/缺氧条件下微生物培养的介质制备

与有氧生物相比，严格的厌氧微生物需要缺氧。由于氧气在空气中随处可见，在栽培过程中保持无氧条件是厌氧栽培的先决条件。应用技术代表了一种简单而廉价的方法，为液体培养混合微生物群提供厌氧条件。

这种技术也可以应用于纯文化的培养。但是，对于高氧敏感微生物，此程序可能不适用。首先在适当的烧瓶中称量中等成分，然后用半体积的蒸馏水溶解。

然后，加入毫升的 REDOX 指标，然后在微量元素溶液中加入维生素。根据生物体要求调整pH，用蒸馏水将最终体积调至1升。REDOX 指示器的颜色取决于 pH，可能需要一些时间来调整。

用50毫升的介质填充120毫升血清瓶，然后在100摄氏度的水浴中孵育20至30分钟，以降低液体阶段氧气的溶解度。用氮气冲洗头部空间。使用氮气时，注意适当的室内通风。

用丁基橡胶隔膜关闭烧瓶，并固定铝盖。接下来，在每个烧瓶中加入0.1毫升的还原剂，以进一步降低 REDOX 电位。在121摄氏度下将烧瓶中20分钟。

在应用本协议时，必须使用经认证的用于灭菌的封闭式容器的自用器。否则，温度升高产生的过压可能会导致血清瓶爆炸。要从厌氧消化池中准备加入，将400毫升蒸馏水加入烧瓶中，煮沸。

冷却至约 30 摄氏度，同时用氮气永久冲洗头部空间。加入约100克从厌氧消化池中提取的污泥，确保记录污泥的确切质量，以确定稀释。用氮气交换烧瓶的头部空间，用丁基橡胶隔膜关闭。

在 120 RPM 下摇动烧瓶 30 分钟。让较大的污泥颗粒沉淀，然后使用注射器和管状物去除5毫升的中分，并将其注入先前准备的血清瓶中。在实验的适当温度下孵育接种的血清瓶，确保在开始孵育后大约 15 到 30 分钟排出温度升高引起的过压。

要评估孵化期间的生物气体产量和成分，请记录当前大气压力，并准备一个气压计来评估烧瓶内的压力。摇动烧瓶，使用注射器和管筒取出 1 毫升头部空间气体。使用气相色谱测量氢气、氧气、甲烷和二氧化碳浓度。

使用1毫升的液体从烧瓶监测所有高脂肪酸的浓度，根据手稿的指示，并排空烧瓶的压力后，它返回到适当的温度。该协议用于创建进行厌氧消化的微型生物反应器。以3种不同的浓度添加色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、肉类提取物和酪素，并在28天的潜伏期监测甲烷生产。

通过辐射共酶F420来可视化甲烷原，F420是甲烷生成中的电子载体，并表现出蓝绿色荧光，吸收最大值为420纳米。在进行气体分析时，对孵化期挥发性脂肪酸和苯基酸浓度进行了样品分析。在实验的某一点，可以使用所述程序应用针对微生物群落丰度和/或组成物的分子生物学方法。