解剖果蝇黑色素组飞行肌肉为奥米克斯方法

该协议有助于解剖GGFP标签的间接飞行肌肉从果蝇在幼崽发育期间的各个时间点，以评估基因和蛋白质表达的变化。使用这些技术，可以实现高富集的飞行肌肉样本，其RNA蛋白降解最小，适用于RT-PCR、西印或奥米方法。这些专门的解剖需要实践和技能，但可解剖的幼崽数量和样品质量会随着经验的提高而提高。

这种解剖的视觉演示对于确定如何区分飞行肌肉和非肌肉组织以及促进飞行肌肉与幼崽标本的快速分离至关重要。要将小狗装出舞台，请使用湿的画笔收集并转移到60毫米的培养皿中，并在双目显微镜下对小狗进行性护理。雄性由睾丸的存在来识别，睾丸在原本不透明的幼崽上显示为半透明的球。

在用苍蝇的时间、日期和基因型标记菜后，在25至27摄氏度的培养箱中对幼崽进行年龄调整，直到适当的阶段。对于 48 H APF 前的 IFM 解剖，使用湿画笔将适当阶段性的 pupae 转移到黑色解剖盘中，约 2/3 充满冷藏 PBS。在荧光解剖显微镜下，使用5个钳子将其中一个钳子推到黑色解剖盘的底部。

调整显微镜变焦和对焦，直到可以清楚地可视化。使用一对钳子抓住幼崽的前部，用第二对钳子的单尖戳幼崽，腹部稍微离中，就在胸部后面。使用第一对钳子取出前半部分的钳子，并捏紧胸后裸露的幼崽，将腹部与胸部分开。

接下来，轻轻挤压胸部前部，露出荧光标记的 IFM。然后，使用钳子将剩余的尸体丢弃到盘子的对面，并同样解剖随后的幼崽。当所有幼崽都解剖后，使用钳子收集 IFM 纤维，并组织纤维放入黑色解剖盘底部的一堆。

使用钳子将任何碎屑从视野中推出，并从样品中去除任何非 IFM 肌肉、脂肪、角质层或其他不需要的组织。然后，使用夹入的移液器尖端将一堆 IFM 转移到包含 250 微升冷却 PBS 的 1.5 毫升微离心管中。对于 48 H APF 后 IFM 解剖，使用轻轻湿润的画笔将暂存的 pupae 转移到安装在显微镜幻灯片上的双面胶带条上。

将小狗定向在一条线上，腹侧向下，然后朝向滑梯底部。当所有钳子都放置好时，使用钳子来梳理，并打开前螺旋上方的第一个钳子，然后轻轻地将一对钳子滑向后部，随着钳子移动，切割钳子。将幼崽从打开的箱子中释放开放，并立即将幼崽转移到第二张显微镜幻灯片上的 PBS 滴。

当所有的幼崽都被释放时，用细剪刀将幼崽的腹部从胸部切开，然后将腹部推入单独的一堆。当所有胸部都切除后，使用一张纸巾去除大部分的PBS和腹部。在剩余的胸体中加入一滴新鲜、冰冷的PBS，然后用剪刀沿着垂直体轴从头部切割，以单次运动将胸部分成两半。

当所有钳子都解剖后，使用 5 个钳子选择其中一个切除，然后轻轻地在 IFM 的中间上方和下方插入一个钳子的尖端。按住第一把钳子，使用细剪刀将 IFM 的一端从角质层和肌腱上切开，然后旋转 180 度，使 IFM 的另一端从角质层和肌腱上切割。使用钳子将 IFM 捆绑包从胸部转移到 PBS 气泡的边缘，使用水张力将捆绑包保持到位。

然后，将尸体推到幻灯片的另一侧，并以这种方式解剖其余的 IFM。收集所有 IFM 后，使用 5 个钳子去除可能进入样本的任何跳跃肌肉或角质层碎片。然后用水张力在一对钳子之间轻轻捕获解剖的 IFM，将 IFM 放在含有 250 微升冷却 PBS 的 1.5 毫升微离心管中。

来自布鲁诺1 IR IFM的mRNA测序数据表明，与野生型测序数据相比，基因单元水平上的表达变化。使用解剖的 IFM 上全蛋白体质谱法，在蛋白质和蛋白质等同形式水平上观察到类似的调控。将蛋白质陷阱线插入 Mhc 的最终内分，在 IFM 中可以观察到 GFP 标记蛋白的合并，在 90 H APF 的 M 线两侧为两个点，而在腿部肌肉组织中，GFP 信号可以在沙康梅 M 线上均匀地观察到。

在解剖的 IFM 上使用 RT-PCR 时，可以在 27 摄氏度形成 27 摄氏度的异常后 30 至 48 小时内检测到从 GFP 标记的 exon 34 到 37 事件的 Mhc 等构开关。从mRNA测序数据，腿部和跳跃肌肉组织表达所有三个Mhc等同形式，保持GGF标签等构体在成熟肌肉的表达。Spalt主要突变体和布鲁诺1 IR-IFM，未能关闭表达的GFP标签Mhc等同形式，因为他们的发展，导致一个等形表达配置文件类似于腿和跳跃肌肉组织。

请记住，解剖应在30分钟内进行，以防止RNA降解。而且，注意限制其他细胞类型的污染。此方法生成适用于生物化学方法（如 RT-PCR 或西印迹）的 IFM 富集样本，以及奥米式方法（如质谱、高通量测序、染色质符合性捕获和代谢组学）。

这些解剖可以补充在果蝇强大的遗传方法与系统级数据，以研究发育和基因调控的基本机制。