Protokol, gen ve protein ekspresyonundaki değişiklikleri değerlendirmek için pupa gelişimi sırasında drosophila'dan çeşitli zaman noktasında GFP etiketli dolaylı uçuş kasının diseksiyonu kolaylaştırıyor. Bu teknikler kullanılarak, rt-PCR, batı leke veya omik yaklaşımlar için uygun minimum RNA protein bozunması ile yüksek zenginleştirilmiş uçuş kas örneği elde edilebilir. Bu özel diseksiyonlar pratik ve beceri gerektirir, ancak kesilebilir pupa sayısı ve örneklerin kalitesi deneyimi ile geliştirmek.
Bu diseksiyonun görsel gösterimi, uçuş kaslarının kas dışı dokulardan nasıl ayırt edilebildiğini belirlemek ve uçuş kaslarının pupal numunelerden hızlı bir şekilde izole edilmesi için çok önemlidir. Pupa sahnelemek için, 60 milimetrelik Petri kabına pre-pupa toplamak ve aktarmak için ıslak bir fırça kullanın ve bir dürbün mikroskobu altında pupa seks. Erkekler, opak pupaüzerinde yarı saydam küreler olarak görünen testislerin varlığıyla tanımlanır.
Yemeği sineklerin zamanı, tarihi ve genotipiyle etiketledikten sonra, pupayı uygun aşamaya kadar 25 ila 27 derece lik bir inkübatörde yaşlayın. 48 H APF'den önce IFM diseksiyonu için, uygun şekilde hazırlanmış pupayı soğutulmuş PBS ile dolu 2/3'lük siyah bir diseksiyon kabına aktarmak için ıslak bir fırça kullanın. Floresan diseksiyon mikroskobu altında, siyah diseksiyon çanak altına pupa birini itmek için 5 forceps kullanın.
Pupa açıkça görselleştirilene kadar mikroskop yakınlaştırma ve odak ayarlayın. Pupanın ön kısmını kavramak için bir çift forceps kullanarak, ikinci bir çift forceps tek bir ucu ile pupa dürtmek, karın biraz kapalı-merkez, toraks hemen arkasında. Pupal kılıfın ön yarısını çıkarmak ve karını torakstan ayırmak için toraksın hemen arkasındaki açıkpayı çimdiklemek için ilk keter leri kullanın.
Daha sonra, floresan etiketli IFM'leri ortaya çıkarmak için toraksın ön kısmını hafifçe sıkın. Daha sonra, kalan leşi yemeğin karşı tarafına atmak için terpleri kullanın ve sonraki pupayı aynı şekilde inceleyin. Tüm pupa kesildi kten sonra, IFM lifleri toplamak için keterkullanın ve siyah kesme çanak altında bir yığın halinde lifleri düzenlemek.
Herhangi bir enkazı görüş alanının dışına itmek için çalgılar kullanın ve ifm olmayan kasları, yağları, piriçleri veya diğer istenmeyen dokuyu örneklerden çıkarın. Daha sonra, IFM yığınını 250 mikrolitre soğutulmuş PBS içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarmak için kırpılmış pipet ucu kullanın. 48 H APF'den sonra IFM diseksiyonu için, sahnelenen pupayı mikroskop kaydıranın üzerine monte edilmiş çift taraflı yapışkan bant şeridine aktarmak için hafifçe ıslak bir fırça kullanın.
Bir çizgi içinde pupa Orient, ventral tarafı aşağı, ve slayt altına doğru ön. Tüm pupa yerleştirildiğinde, ayrı kızdırmak ve ön spiracles üzerinde ilk pupal durumda açmak için forceps kullanın, ve yavaşça posterior doğru, forceps dorsally bir çift slayt, forceps hareket olarak pupal durumda kesme. Pupayı açılan kasadan kurtarın ve hemen ikinci bir mikroskop slaytında pupayı bir damla PBS'ye aktarın.
Tüm pupa serbest bırakıldığında, uzak toraks pupa karın kesmek için ince makas kullanın, ve ayrı bir yığın içine karın itin. Tüm toraks lar çıkarıldığında, PBS çoğunluğu ve karın yığını kaldırmak için bir kağıt mendil kullanın. Kalan torakslara taze, soğutulmuş PBS bir damla ekleyin, tek bir hareketle toraks ikiye bölmek için uzunlamasına vücut ekseni boyunca kafa kesmek için makas kullanmadan önce.
Tüm pupalar incelendiğinde, hemikesitlerden birini seçmek için 5 forceps kullanın ve ifm'lerin ortasına ve altına bir tane tane sinin uçlarını nazikçe yerleştirin. İlk çift forceps'ü hala tutarak, pupa180 derecedöndürmeden önce, IFM'nin bir ucunu miğkül ve tendondan uzaklaştırmak için ince makas kullanın. IFM paketini torakstan PBS kabarcığın kenarına aktarmak için, paketi yerinde tutmak için su gerilimini kullanarak forcep'leri kullanın.
Ardından, karkas slaytın karşı tarafına doğru itin ve IFM'lerin geri kalanını aynı şekilde inceleyin. IFM'lerin tümü toplandığında, numunelerin içine giden yolu bulmuş olabilecek herhangi bir atlama kası veya manikür parçalarını çıkarmak için 5 forceps kullanın. Daha sonra bir çift forceps arasında parçalanmış IFM'leri nazikçe yakalamak ve IFM'leri 250 mikrolitre soğutulmuş PBS içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirmek için su gerilimini kullanın.
BRUNO1 IR IFM'lerden alınan mRNA sıralama verileri, yabani tip sıralama verilerine göre gen birimi düzeyinde ekspresyon değişiklikleri gösterir. Diseksiyonlu IFM'lerde tüm proteom kütle spektrometresi kullanılarak protein ve protein izoform düzeylerinde de benzer bir düzenleme gözlenmektedir. Mhc'nin son introniçine bir protein tuzak hattı yerleştirildikten sonra, GFP etiketli proteinin dahil edilmesi IFM'de M-line'ın her iki tarafında 90 H APF'de iki nokta olarak gözlemlenebilirken, bacak kası dokusunda GFP sinyali sarcomere M-line boyunca düzgün bir şekilde gözlemlenebilir.
Parçalanan IFM'de RT-PCR kullanılırken, GFP etiketli ekson 34-37 olayından etiketsiz ekson 34-35 olayına kadar bir Mhc izoform anahtarı, 27 santigrat derecede puparium oluşumundan 30 ila 48 saat sonra tespit edilebilir. MRNA dizileme verilerinden, bacak ve atlama kas dokuları üç Mhc izoformunu da ifade eder ve olgun kaslarda GFP etiketli izoformun ekspresyonunu korur. Hem Spalt majör mutant ve BRUNO1 IR-IFM, gfp etiketli Mhc izoform un ekspresyonunu kapatmayı başaramadılar, bu da bacak ve atlama kas dokusuna benzeyen izoform bir ifade profili ile sonuçlandı.
RNA bozulmasını önlemek için diseksiyonlar30 dakikadan daha az bir dakika içinde yapılmalıdır unutmayın. Ve, diğer hücre tipleri tarafından kontaminasyon sınırlamak için dikkat etmek. Bu yöntem, RT-PCR veya batı lekeleme gibi biyokimyasal yaklaşımlara uygun IFM ile zenginleştirilmiş örneklerin yanı sıra kütle spektrometresi, yüksek iş elde ekiseri, kromatin konformasyon yakalama ve metabolomik gibi omik stil yaklaşımları oluşturur.
Bu diseksiyonlar Drosophila'daki güçlü genetik yaklaşımları, gelişme ve gen düzenlemesinin temel mekanizmalarını araştırmak için sistem düzeyinde verilerle tamamlayabilir.
