הפרוטוקול מקל על ניתוח של שריר טיסה עקיף שכותרתו GFP מ Drosophila בנקודת זמן שונים במהלך התפתחות גלמים כדי להעריך שינויים בביטוי גנים וחלבון. באמצעות טכניקות אלה, ניתן להשיג דגימת שרירי טיסה מועשרת גבוהה עם השפלה מינימלית של חלבון RNA המתאימה ל-RT-PCR, כתם מערבי או גישות אומיות. ניתוחים מיוחדים אלה דורשים תרגול ומיומנות, אך מספר הגלמים שניתן לנתח ואיכות הדגימות משתפרים עם הניסיון.
הדגמה חזותית של ניתוח זה היא קריטית לקביעת האופן שבו ניתן להבחין בין שרירי טיסה לבין רקמות שאינן שרירים ולהקל על הבידוד המהיר של שרירי הטיסה מדגימות הפופאליות. כדי לביים את הגלמים, השתמשו במברשת צבע רטובה כדי לאסוף ולהעביר לפני הגלמים לצלחת פטרי 60 מ"מ, וסקס הגלמים תחת מיקרוסקופ משקפת. זכרים מזוהים על ידי נוכחות של אשכים, המופיעים כגלובוסים שקופים על הגלמים אטומים אחרת.
לאחר תיוג המנה עם השעה, התאריך והגנוטיפ של הזבובים, מזדקנים הגלמים באינקובטור של 25 עד 27 מעלות צלזיוס עד לשלב המתאים. עבור ניתוח IFM לפני 48 שעות APF, השתמשו במברשת צבע רטובה כדי להעביר את הגלימה המבוימת כראוי לצלחת ניתוח שחורה בערך 2/3 מלאה ב- PBS מקורר. תחת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, השתמש 5 מלקחיים כדי לדחוף את אחד הגלמים לתחתית צלחת ניתוח שחור.
כוונן את גודל התצוגה של המיקרוסקופ והתמקד עד שניתן יהיה לדמיין בבירור את הגלמים. באמצעות זוג אחד של ממטרים כדי לתפוס את החלק העליון של הגולה, לתקוע את הגולה עם קצה אחד של זוג שני של מדפים, מעט מחוץ למרכז בבטן, ממש מאחורי בית החזה. השתמש בזוג המדפים הראשון כדי להסיר את החצי הראשון של מארז הגופל, ולצבוט את הגלם החשוף ממש מאחורי בית החזה כדי להפריד את הבטן מבית החזה.
לאחר מכן, לסחוט בעדינות את החלק הראשון של בית החזה כדי לחשוף את IFMs שכותרתו פלואורסצנטי. לאחר מכן, השתמש במדפים כדי להשליך את הפגר הנותר לצד הנגדי של המנה, ול לנתח את הגלמים הבאים באותו אופן. כאשר כל הגלמים נותאו, השתמש במלקחיים כדי לאסוף את סיבי ה- IFM, וארגן את הסיבים לערימה בתחתית צלחת הת לנתח שחור.
השתמש במטחנים כדי לדחוף את כל הפסולת מחוץ לשדה המבט, ולהסיר את כל השרירים שאינם IFM, שומן, cuticles, או רקמה לא רצויה אחרת מן הדגימות. לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה קצוץ כדי להעביר את הערימה של IFMs לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל 250 microliters של PBS מקורר. עבור ניתוח IFM לאחר 48 H APF, השתמש במברשת צבע רטובה קלות כדי להעביר את הגלימה המבוימת לרצועה של סרט דביק דו-צדדי המותקן על שקופית מיקרוסקופ.
כוון את הגלמייה בשורה, צד הגחוני כלפי מטה, וחזיתי לכיוון תחתית השקופית. כאשר כל הגלמים הונחו, השתמש במטליות כדי להקניט ולפתוח את המארז הגומי הראשון מעל הצריחים האחוריים, ולהחליק בעדינות זוג מדפים באופן דורסי, לכיוון האחורי, חיתוך המקרה הגופל כמו המדפים לנוע. שחררו את הגלמים מהתיק שנפתח, ומיד מעבירים את הגלמים לירידה של PBS בשקופית מיקרוסקופ שנייה.
כאשר כל הגלמים משוחררים, השתמש במספריים עדין כדי לחתוך את הבטן של הגלמים הרחק מבית החזה, ולדחוף את הבטן לתוך ערימה נפרדת. כאשר כל בית החזה הוסרו, להשתמש בפיסת נייר טישו כדי להסיר את רוב PBS ואת ערימת הבטן. מוסיפים טיפה של PBS טרי ומצונן לבית החזה הנותר, לפני השימוש במספריים כדי לחתוך מהראש לאורך ציר הגוף האורך בתנועה אחת כדי לחלק את בית החזה לשניים.
כאשר כל הגלמים נותחו, השתמש ב- 5 המדפים כדי לבחור אחד מההמיות, והכנס בעדינות את קצות המדפים מעל ומתחת לאמצע ה- IFMs. מחזיק את הזוג הראשון של מדפים עדיין, להשתמש מספריים בסדר לחתוך קצה אחד של IFM מן קוטיקל וגידים, לפני סיבוב הגלמים 180 מעלות, כדי לאפשר את הקצה השני של IFM להיות חתוך חופשי מן קוטיקל וגידים. השתמש במדפים כדי להעביר את צרור IFM מבית החזה לקצה בועת PBS, באמצעות מתח מים להחזיק את החבילה במקום.
לאחר מכן, לדחוף את הפגר לצד הנגדי של השקופית, ול לנתח את שאר IFMs באותו אופן. כאשר כל IFMs נאספו, להשתמש 5 מדפים כדי להסיר כל שריר לקפוץ או שברי cuticle שאולי מצאו את דרכם לתוך הדגימות. לאחר מכן השתמש במתח מים כדי ללכוד בעדינות את ה- IFMs שנותחו בין זוג ממטרים, והצב את ה- IFMs בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל 250 מיקרוליטר של PBS מקורר.
נתוני ריצוף mRNA מ- BRUNO1 IR IFMs מציגים שינויים בביטוי ברמת יחידת הגנים בהשוואה לנתונים של רצף סוגי בר. באמצעות ספקטרומטריית מסת פרוטאום שלמה על IFMs נותחו, ויסות דומה נצפתה ברמות החלבון והחלבון. לאחר החדרת קו מלכודת חלבון לאנטרון הסופי של Mhc, ניתן לראות את שילוב החלבון המסומן ב- GFP ב- IFM כשתי נקודות משני צדי קו ה- M ב- 90 H APF, בעוד ברקמת שריר הרגל ניתן לראות את אות ה- GFP באופן אחיד לאורך קו ה- M sarcomere.
בעת שימוש ב- RT-PCR ב- IFM שנותח, ניתן לזהות מתג isoform Mhc מהאקסון 34 עד 37 בעל התווית GFP לאירוע אקסון ללא תווית 34 עד 35, בין 30 ל -48 שעות לאחר היווצרות הפופריום ב 27 מעלות צלזיוס. מנתוני רצף mRNA, רקמות שריר הרגל והקפיצה מבטאות את כל שלושת האיזופורמים של Mhc, תוך שמירה על ביטוי האיזופורם המסומן ב- GFP בשריר בוגר. הן המוטנט הגדול Spalt והן BRUNO1 IR-IFM, לא הצליחו לכבות את הביטוי של isoform Mhc שכותרתו GFP כפי שהם מתפתחים, וכתוצאה מכך פרופיל ביטוי isoform דומה לזה של רקמת שריר רגל לקפוץ.
זכור כי הניתוחים צריכים להתבצע בתוך פחות מ -30 דקות כדי למנוע השפלה RNA. וגם, כדי לדאוג להגביל את הזיהום על ידי סוגי תאים אחרים. שיטה זו מייצרת דגימות מועשרות ב- IFM המתאימות לגישות ביוכימיות כגון RT-PCR, או כתמים מערביים, כמו גם גישות בסגנון אומי, כמו ספקטרומטריית מסה, רצף תפוקה גבוה, לכידת קונפורמציה כרומטינית ומטבולומיקה.
ניתוחים אלה יכולים להשלים את הגישות הגנטיות החזקות בדרוסופילה עם נתונים ברמת המערכות לחקירת המנגנונים הבסיסיים של פיתוח ווויסות גנים.
