Il protocollo facilita la dissezione del muscolo di volo indiretto etichettato GFP dalla Drosophila in vari punti di tempo durante lo sviluppo delle pupe per valutare i cambiamenti nell'espressione genica e proteica. Utilizzando queste tecniche, è possibile ottenere un campione muscolare di volo ad alto arricchimento con una minima degradazione delle proteine dell'RNA adatto per approcci RT-PCR, western blot o omic. Queste dissezioni specializzate richiedono pratica e abilità, ma il numero di pupe che possono essere sezionate e la qualità dei campioni migliorano con l'esperienza.
La dimostrazione visiva di questa dissezione è fondamentale per determinare come distinguere i muscoli di volo dai tessuti non muscolari e facilitare il rapido isolamento dei muscoli di volo dagli esemplari pupali. Per in scena le pupe, utilizzare un pennello bagnato per raccogliere e trasferire pre-pupe in una piastra di Petri di 60 millimetri e fare sesso con le pupe al microscopio binoculare. I maschi sono identificati dalla presenza di teste, che appaiono come globi traslucidi sulle pupe altrimenti opache.
Dopo aver etichettato il piatto con l'ora, la data e il genotipo delle mosche, invecchiare le pupe in un'incubatrice da 25 a 27 gradi Celsius fino allo stadio appropriato. Per la dissezione IFM prima di 48 H APF, utilizzare un pennello bagnato per trasferire le pupe opportunamente messe in scena in un piatto di sezionatura nera circa 2/3 riempito con PBS refrigerato. Sotto il microscopio di sezionamento fluorescente, utilizzare un 5 forcep per spingere una delle pupe sul fondo del piatto di sezionazione nero.
Regolare lo zoom e la messa a fuoco del microscopio fino a quando le pupe non possono essere chiaramente visualizzate. Usando un paio di forcep per afferrare la parte anteriore delle pupe, colpisce le pupe con una singola punta di un secondo paio di forcep, leggermente fuori centro nell'addome, appena dietro il torace. Utilizzare il primo paio di forcep per rimuovere la metà anteriore della custodia pupale e per pizzicare le pupe esposte appena dietro il torace per separare l'addome dal torace.
Quindi, spremere delicatamente la parte anteriore del torace per esporre gli IFM etichettati fluorescentmente. Quindi, utilizzare le forcep per scartare la carcassa rimanente sul lato opposto del piatto e sezionare le pupe successive nello stesso modo. Quando tutte le pupe sono state sezionate, utilizzare le forcep per raccogliere le fibre IFM e organizzare le fibre in una pila nella parte inferiore del piatto di sezionazione nero.
Utilizzare le forcep per spingere eventuali detriti fuori dal campo visivo e rimuovere eventuali muscoli non IFM, grasso, cuticole o altri tessuti indesiderati dai campioni. Quindi, utilizzare una punta di pipetta ritagliata per trasferire la pila di IFM in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente 250 microlitri di PBS refrigerato. Per la dissezione IFM dopo 48 H APF, utilizzare un pennello leggermente bagnato per trasferire le pupe messe in scena su una striscia di nastro adesivo a doppia parte montato su uno scivolo al microscopio.
Orientare le pupe in una linea, lato ventrale verso il basso e anteriore verso il fondo dello scivolo. Quando tutte le pupe sono state posizionate, utilizzare le flessori per prendere in giro e aprire il primo caso pupale sopra gli spiracoli anteriori e far scivolare delicatamente un paio di forcep dorsalmente, verso il posteriore, tagliando la custodia pupale mentre le forcep si muovono. Libera le pupe dalla custodia aperta e trasferisci immediatamente le pupe in una goccia di PBS su un secondo scivolo al microscopio.
Quando tutte le pupe vengono liberate, utilizzare forbici fini per tagliare l'addome delle pupe lontano dal torace e spingere gli addome in una pila separata. Quando tutti i torace sono stati rimossi, utilizzare un pezzo di carta velina per rimuovere la maggior parte del PBS e la pila di addome. Aggiungere una goccia di PBS fresco e refrigerato ai torace rimanenti, prima di utilizzare le forbici per tagliare dalla testa lungo l'asse longitudinale del corpo in un unico movimento per dividere il torace a metà.
Quando tutte le pupe sono state sezionate, utilizzare le 5 forcep per selezionare una delle emisezioni e inserire delicatamente le punte di una forza sopra e sotto il centro degli IFM. Tenendo fermo il primo paio di forcep, utilizzare forbici fini per tagliare un'estremità dell'IFM lontano dalla cuticola e dai tendini, prima di ruotare le pupe di 180 gradi, per consentire all'altra estremità dell'IFM di essere tagliata libera dalla cuticola e dai tendini. Utilizzare le forcep per trasferire il fascio IFM dal torace al bordo della bolla PBS, utilizzando la tensione dell'acqua per mantenere il fascio in posizione.
Quindi, spingere la carcassa sul lato opposto della diapositiva e sezionare il resto degli IFM nello stesso modo. Una volta raccolti tutti gli IFM, utilizzare le 5 forcep per rimuovere eventuali frammenti di muscoli di salto o cuticola che potrebbero aver trovato la loro strada nei campioni. Quindi utilizzare la tensione dell'acqua per catturare delicatamente gli IFM sezionati tra un paio di forcep e posizionare gli IFM in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente 250 microlitri di PBS refrigerato.
I dati di sequenziamento dell'mRNA degli IFM IR BRUNO1 mostrano cambiamenti nell'espressione a livello di unità genica rispetto ai dati di sequenziamento dei tipi selvatici. Utilizzando la spettrometria di massa del proteoma intero sugli IFM sezionati, si osserva una regolazione simile ai livelli di isoformi proteici e proteici. Dopo l'inserimento di una linea di trappola proteica nell'introne finale di Mhc, l'incorporazione della proteina etichettata GFP può essere osservata in IFM come due punti su entrambi i lati della linea M a 90 H APF, mentre nel tessuto muscolare delle gambe il segnale GFP può essere osservato uniformemente attraverso la linea M del sarcomero.
Quando si utilizza RT-PCR su IFM sezionato, è possibile rilevare un interruttore isoformico Mhc dall'evento esone 34 a 37 con etichetta GFP all'evento esone non etichettato da 34 a 35, tra 30 e 48 ore dopo la formazione del puparium a 27 gradi Celsius. Dai dati di sequenziamento dell'mRNA, i tessuti muscolari delle gambe e del salto esprimono tutte e tre le isoforme Mhc, mantenendo l'espressione dell'isoforma etichettata GFP nel muscolo maturo. Sia spalt mutante maggiore che BRUNO1 IR-IFM, non sono riusciti a disattivare l'espressione dell'isoforma Mhc etichettata GFP mentre si sviluppano, risultando in un profilo di espressione isoforma simile a quello del tessuto muscolare gamba e salto.
Ricorda che le dissezioni devono essere eseguite in meno di 30 minuti per prevenire la degradazione dell'RNA. E, per fare attenzione a limitare la contaminazione da altri tipi di cellule. Questo metodo genera campioni arricchiti di IFM adatti ad approcci biochimici come RT-PCR, o western blotting, così come approcci di stile omico, come spettrometria di massa, sequenziamento ad alta velocità effettiva, acquisizione della conformazione della cromatina e metabolomica.
Queste dissezioni possono integrare i potenti approcci genetici in Drosophila con dati a livello di sistema per indagare i meccanismi fondamentali dello sviluppo e della regolazione genica.
