O protocolo facilita a dissecção do músculo de voo indireto rotulado por GFP de Drosophila em vários momentos durante o desenvolvimento de pupas para avaliar mudanças na expressão genética e proteica. Usando essas técnicas, pode-se alcançar uma amostra muscular de voo ricamente enriquecida com degradação mínima da proteína RNA que seja adequada para rt-PCR, mancha ocidental ou abordagens omicinas. Essas dissecções especializadas exigem prática e habilidade, mas o número de pupas que podem ser dissecadas e a qualidade das amostras melhoram com a experiência.
A demonstração visual desta dissecção é fundamental para determinar como distinguir os músculos de voo dos tecidos não musculares e facilitar o rápido isolamento dos músculos de voo dos espécimes pupais. Para encenar a pupae, use um pincel molhado para coletar e transferir pré-pupae para uma placa de Petri de 60 milímetros, e sexo com a pupa sob um microscópio binóculo. Os machos são identificados pela presença de testículos, que aparecem como globos translúcidos na pupae opaca.
Depois de rotular o prato com a hora, data e genótipo das moscas, aduque a pupae em uma incubadora Celsius de 25 a 27 graus até o estágio apropriado. Para dissecção IFM antes de 48 H APF, use um pincel molhado para transferir a pupae adequadamente encenada para um prato de dissecação preto cerca de 2/3 cheio de PBS refrigerado. Sob o microscópio de dissecação fluorescente, use um 5 fórceps para empurrar uma das pupas para o fundo do prato de dissecação preto.
Ajuste o zoom do microscópio e foque até que a pupae possa ser claramente visualizada. Usando um par de fórceps para agarrar o anterior da pupae, cutuque a pupa com uma única ponta de um segundo par de fórceps, ligeiramente fora do centro no abdômen, logo atrás do tórax. Use o primeiro par de fórceps para remover a metade anterior da caixa pupal, e para beliscar a pupae exposta logo atrás do tórax para separar o abdômen do tórax.
Em seguida, aperte suavemente a parte anterior do tórax para expor os IFMs rotulados fluorescentemente. Em seguida, use os fórceps para descartar a carcaça restante para o lado oposto do prato, e dissecar a pupae subsequente da mesma maneira. Quando todas as pupas forem dissecadas, use os fórceps para coletar as fibras IFM e organize as fibras em uma pilha no fundo do prato de dissecação preto.
Use os fórceps para empurrar quaisquer detritos para fora do campo de visão, e remover quaisquer músculos não IFM, gordura, cutículas ou outro tecido indesejado das amostras. Em seguida, use uma ponta de pipeta cortada para transferir a pilha de IFMs para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 250 microliters de PBS refrigerado. Para dissecção IFM após 48 H APF, use um pincel levemente molhado para transferir o pupae encenado para uma tira de fita adesiva de dois lados montada em um slide de microscópio.
Oriente a pupae em uma linha, lado ventral para baixo, e anterior em direção ao fundo do slide. Quando todas as pupas tiverem sido colocadas, use fórceps para provocar à parte e abrir o primeiro caso pupal acima dos espirros anteriores, e deslize suavemente um par de fórceps dormentes, em direção ao posterior, cortando a caixa de pupal à medida que as fórceps se movem. Liberte a pupa da caixa aberta, e transfira imediatamente a pupae para uma gota de PBS em um segundo slide de microscópio.
Quando todas as pupas forem libertadas, use uma tesoura fina para cortar o abdômen da pupa para longe do tórax, e empurre os abdômens para uma pilha separada. Quando todos os tóraxs tiverem sido removidos, use um pedaço de papel de tecido para remover a maioria da PBS e a pilha de abdômens. Adicione uma gota de PBS fresco e refrigerado aos tóraxs restantes, antes de usar a tesoura para cortar da cabeça ao longo do eixo longitudinal do corpo em um único movimento para dividir o tórax ao meio.
Quando todas as pupas tiverem sido dissecadas, use os 5 fórceps para selecionar uma das hemiseções e insira suavemente as pontas de um fórceps acima e abaixo do meio dos IFMs. Segurando o primeiro par de fórceps parados, use uma tesoura fina para cortar uma extremidade do IFM longe da cutícula e dos tendões, antes de girar a pupae de 180 graus, para permitir que a outra extremidade do IFM seja cortada livre da cutícula e dos tendões. Use fórceps para transferir o feixe IFM do tórax para a borda da bolha PBS, usando tensão de água para manter o feixe no lugar.
Em seguida, empurre a carcaça para o lado oposto do slide e disseca o resto dos IFMs da mesma maneira. Quando todos os IFMs tiverem sido coletados, use os 5 fórceps para remover qualquer músculo de salto ou fragmentos de cutícula que possam ter encontrado seu caminho para as amostras. Em seguida, use a tensão da água para capturar suavemente os IFMs dissecados entre um par de fórceps e coloque os IFMs em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 250 microliters de PBS refrigerado.
os dados de sequenciamento mRNA do BRUNO1 IR IFMs mostram alterações na expressão no nível da unidade genética em comparação com os dados de sequenciamento do tipo selvagem. Utilizando espectrometria de massa proteome inteira em IFMs dissecados, uma regulação semelhante é observada nos níveis de isoforme de proteína e proteína. Após a inserção de uma linha de armadilha de proteína no intron final do MHC, a incorporação da proteína rotulada por GFP pode ser observada em IFM como dois pontos em ambos os lados da linha M a 90 H APF, enquanto no tecido muscular da perna o sinal GFP pode ser observado uniformemente através da linha M sarcomere.
Ao usar o RT-PCR no IFM dissecado, um interruptor isoforme mhc do evento de exon rotulado gfp 34 para 37 para o evento exon não rotulado 34 a 35, pode ser detectado entre 30 e 48 horas após a formação do pupário a 27 graus Celsius. A partir de dados de sequenciamento mRNA, os tecidos musculares de perna e salto expressam todos os três isoformes de Mhc, mantendo a expressão do isoforme rotulado gfp em músculo maduro. Tanto o mutante maior de Spalt quanto o BRUNO1 IR-IFM, não conseguiram desligar a expressão do isoform mhc rotulado por GFP à medida que se desenvolvem, resultando em um perfil de expressão isoforme semelhante ao do tecido muscular da perna e do salto.
Lembre-se que as dissecções devem ser realizadas em menos de 30 minutos para evitar a degradação do RNA. E, tomar cuidado para limitar a contaminação por outros tipos de células. Este método gera amostras enriquecidas pelo IFM adequadas para abordagens bioquímicas como RT-PCR, ou manchas ocidentais, bem como abordagens de estilo omica, como espectrometria de massa, sequenciamento de alta produtividade, captura de conformidade de cromatina e metabolômica.
Essas dissecções podem complementar as poderosas abordagens genéticas em Drosophila com dados de nível de sistemas para investigar os mecanismos fundamentais de desenvolvimento e regulação genética.
