全斑马鱼胚胎的延长时移共聚焦显微镜的分层安装方法

我们开发了一种延时成像的安装方法，允许脆弱的斑马鱼胚胎不受限制地生长，同时将它们保持在一个完全固定的位置。这种安装方法快速、简单、便宜，适用于任何倒置显微镜上的实验室成像。我们开发了这种活斑马鱼胚胎成像方法，但可以修改用于其他小型水生动物模型的成像。

首先繁殖成年斑马鱼。下午，将鱼放入养殖池中，以一对二的雄女比例。然后在胚胎介质中准备1%低熔糖的库存溶液，然后用微波炉加热溶解。

将阿加罗斯溶液分成1.5毫升管。在蒸馏水中制造4%三丁的库存溶液，并在4摄氏度下储存加糖和三分。三层是有毒的，必须称重，并准备在烟罩。

交配后，在培养皿中收获E3中的斑马鱼胚胎，并在26.5摄氏度下孵育约28小时，然后安装。用0.02%三叶草麻醉胚胎，并在显微镜下通过轻轻抓住和拉开胆小子来释放胚胎来除去胚胎。在安装之前，将阿加罗斯溶液加热到65摄氏度，然后让它冷却到大约30摄氏度，这样胚胎不会受到热的伤害，并在加糖溶液中加入三糖溶液。

使用 35 毫米玻璃底盘，底部为零盖玻璃。用玻璃移液器或微移液器轻轻将一个侧侧朝向盘子底部的脱光胚胎，然后用微移管小心地取出剩余的 E3。将第一个阿加罗斯溶液添加到小井中，该小井由附着在盘子底部的盖玻璃制成，以覆盖胚胎，确保红糖覆盖小井，但不会溢出。

用盖玻璃盖住小井，在两个盖玻璃之间用胚胎创造一个狭窄的充满糖的空间。将一层1%的加糖溶液放在盘子底部的盖玻璃上，在盖玻璃凝固时保持盖玻璃就位。然后用含有0.02%三分素的E3填充菜的其余部分，以保持系统水分。

为了确定第一层的最佳阿加罗斯浓度，将胚胎安装在增加阿加罗斯浓度中，并进行延时成像，以识别最小化胚胎变形和活力的浓度，然后根据结果测试更精细的浓度范围。该协议最关键的步骤是确定第一层中阿加罗斯的最佳浓度。测试不同纳米浓度的阿加罗斯，如0.030%0.032%等。

以找到最佳浓度。要对胚胎进行延时成像，请使用显微镜阶段，孵化器设置为 28.5 摄氏度，图像长达 55 小时。要同时成像多个胚胎，请使用一个舞台适配器，该适配器可以容纳多个菜盘，然后一个旋转盘子，使胚胎水平定位。

选择一个低放大镜，然后使用目镜定位胚胎，最后通过旋转盘子水平对齐胚胎。在软件中记录胚胎的位置，并创建一个文件名，用于自动保存数据。设置针孔大小、扫描速度、图像大小和缩放。

然后选择要拍摄的图像和荧光通道的放大倍率更高。对于每个通道，调整激光功率和探测器高电压，确保收集最佳动态范围，同时避免饱和和限制照片漂白。接下来，以10倍的目标对整个胚胎进行成像，在软件中设置大图像捕获设置，以对多个视场进行成像，并将它们拼接在一起，调整胚胎的位置，以确保它适合这个大型图像区域。

根据手稿方向配置捕获 Z 堆栈的设置。为了在长期延时成像期间保持多个胚胎的焦点，请使用自动对焦并调整每个胚胎的单个偏移水平，以聚焦在参考平面上。然后在显微镜软件中设置延时参数，以一小时间隔拍摄 55 小时的图像。

在每个周期中，按顺序捕获两个胚胎数据集并自动保存数据。使用显微镜软件处理图像。如果对多个胚胎进行成像，则根据成像位置拆分数据集，为每个胚胎创建独立的文件。

使用最大强度投影或类似工具将 3D 时间数据集转换为 2D 时间数据集。最后，创建影片文件，将保存为 AVI，并选择具有 200 毫秒间隔的"无压缩"选项，使播放速度为每秒 5 帧。这种分层安装方法使得斑马鱼胚胎能够成像，同时允许它们生长，但同时限制它们的运动。

如果阿加罗斯浓度过高，胚胎会变形。但是，如果太低，他们会在延时显微镜期间移出视野。发现最佳琼糖浓度在0.028至0.034%之间，活生生斑马鱼在整个胚胎中表达RFP，血管内皮细胞中的GFP被成像55小时，在此期间，间体血管发芽，下一个测试和头部血管发育，并发生与延伸躯干的发源性静脉凝结。

表达GP和运动神经元的胚胎被成像以可视化运动神经元的发展。运动神经元轴子从腹神经管向胚胎的腹侧发芽。运动神经元轴与分体间血管位置相关的后向发芽的共开发用较高的放大倍率进行成像。

这使得可以可视化腹轴发芽的精细细节，以及从神经管发芽的后轴。随着索米特数量的增加，索米特的长度和宽度也会延长。这个过程是使用转基因胚胎在肌肉中表达GP的图像。

由于阿加罗斯的最佳浓度非常窄，因此在制备阿加罗斯的库存溶液时，对测量的小变化非常敏感，因此需要为每一批新一批的阿加罗斯溶液重新定义。仔细设置成像参数（包括图像大小和分辨率、扫描速度、变焦、探测器高压和激光功率）非常重要，以确保实验之间的一致性，并降低长期延时成像期间发生照片毒性和照片漂白的可能性。使用这种安装方法进行转基因斑马鱼胚胎，然后对整个生物体进行延长的延时成像，我们可以直观地看到不同的组织是如何共同发育的。