目前的纤毛分析方法是劳动密集型的，容易出现错误和偏差。我们的方法旨在简化时间和精力，同时减轻潜在的错误。该技术提供的主要优点是增加了严谨性和可重复性以及定量图像分析。
这种类型的方法不仅与纤毛分析有关，而且可以广泛应用于许多细胞生物学问题，包括那些涉及其他细胞器和细胞骨架蛋白的问题。首先，打开训练数据集，从菜单中选择文件，单击导入导出，然后选择从文件序列创建 ND 文件。选择包含训练数据集的文件夹，文件列表将在对话窗口的中心打开。
使用下拉菜单中的至少一个选项手动定义文件的组织。在每个选定选项下输入相应的数值，并在未选择选项的位置选择"无"。单击"转换"以打开 ND 文档。
要校准图像，请右键单击图像左下角的未校准选项。单击校准文档，然后单击像素大小，输入值并单击确定。选择视图分析控件，打开二进制工具栏，然后选择自动检测或绘制对象，通过精确跟踪所有打开的帧上的单个纤毛结构来手动识别纤毛。
要训练 AI，请选择 nis。ai，点击火车段。ai 打开列车段。
框，然后选择要用于训练的源通道。选择适当的 GroundTruth 二进制文件来训练 AI。根据二进制大小和分布选择训练 AI 所需的迭代次数，然后选择目标文件夹以保存训练的 AI 文件，然后单击训练以训练软件。此过程需要几个小时。
通过转换样品打开前面所述的纤毛的实验共聚焦图像。TIF 文件到 ND2 文件。在弹出窗口中，从第一个下拉菜单中选择多点，然后输入与图像总数相对应的值。
在第二个下拉框中，选择"波长"，然后将值更改为文件夹中通道的总数。该软件将自动解锁位于弹出窗口底部右端的波长选择窗口。在波长选择窗口中，使用颜色下拉菜单选择每个通道的颜色。
在名称列下为每个频道提供不同的名称。更新所有信息后，点击转换。如前所述校准图像。
确保实验数据集的像素大小与训练数据集的像素大小一致。通过使用上一步中经过训练的 AI 识别第一个通道上的纤毛。打开 nis。
ai 从菜单中，选择段。ai，然后在源通道中选择 AC3。然后通过在源通道中选择 MCHR1 来识别第二通道上的纤毛。
该软件将在标记的纤毛上绘制二进制文件。接下来，检查图像中是否有任何错误识别的二进制文件。在二进制工具栏中选择"删除对象"以手动删除错误识别的二进制文件。
一旦纤毛被识别和分割，使用一般分析三工具分析不同的纤毛参数，如长度和强度。从菜单中选择图像，然后单击新的GA3配方。将打开一个中心有空白的新窗口。
GA3将自动检测根据AI适当标记的二进制文件，并包括相应的节点。GA3还会自动检测图像中的通道，并在通道下显示其选项卡。AI将分割框架中所有类似纤毛的物体，并沿框架边缘检测不完整的纤毛。
若要删除它们，请选择二进制处理，删除对象，然后将触摸边框节点拖动到空白区域，并将该节点连接到相应的二进制文件。要测量纤毛长度，请选择测量对象大小，然后选择长度。将参数拖放到中心并连接到相应的二进制节点。
要测量纤毛强度，请选择一些物体强度。将参数拖放到中心，然后连接到感兴趣的相应二进制节点和通道。在测量菜单中，转到目标比率法并选择曼德系数，通过测量单个纤毛内两个通道的重叠来设置GA3中的共定位途径。
将曼德系数节点拖放到空白区域，并将其连接到相应的二进制数和通道。通过打开数据管理菜单对测量值和单个表进行 ApEn。在基本类别中，选择"ApEn"列，然后单击"立即运行"以测量纤毛。
所有测量值将显示在单个输出表中。代表性图像表明，经过训练的AI在IMCD细胞，原发性下丘脑培养物和海马培养物的图像中在体外正确识别纤毛，但没有其他非睫状结构，例如细胞动力学桥。纤毛的长度在IMCD细胞中为0.5至4.5微米，在下丘脑和海马培养物中为2至12微米。
AI测量了AC3标记的纤毛在体内的弧形核，心室旁核和角膜一个区域的图像中的长度。根据分析，体内下丘脑纤毛的范围从1到15微米，如白色和棕色条状物所示。而纤毛和角膜区域的范围从1到10微米不等，如灰色条形所示。
有趣的是，脑室旁核中睫状体MCHR1的强度比弓形核中的强度更强。绘制了MCHR1与AC3的强度以测量它们的重叠。大多数纤毛对两种标志物均呈阳性，而一些纤毛对AC3或MCHR1呈阳性。
为了量化AC3中MTHR1的共定位，测量了Mander的重叠系数，并且脑室旁核的重叠比弧形核的重叠显着增加。为了测量沿着纤毛长度的强度，使用Centrin2-GFP作为基底体标志物来定义纤毛极性。这允许区分纤毛的底部与ARL13B-M樱桃阳性纤毛的尖端。
观察到沿着纤毛长度的ARL13B强度的变化，其中ARL13B强度在基部高于在弧形核的纤毛尖端，见左图，以及PVN，如右图所示。使用这种方法分析数据时，重要的是要确保实验数据集的质量和分辨率与用于训练AI的数据集一致。这种方法的主要用途是，在通过AI检测纤毛后，用户可以通过自定义软件中集成的分析工作流程来创造性地分析哪些属性。
