该协议能够评估所有年龄段沙鼠耳蜗中的突触完整性。这对于听力问题的基础研究非常重要，特别是由于衰老。该方案相对较快，可从耳蜗沿线的几个位置生成定量数据。
此外，它通过使用自发荧光淬灭剂来解决组织老化的特定问题。突触变性是耳蜗功能丧失的最早迹象。量化它是研究开发突触病非侵入性诊断工具的重要工具。
人工耳蜗解剖是需要练习的最关键的部分，所以最好从非实验性耳蜗开始。首先去除大疱。用剪刀切开骨头或用镊子开裂骨头，然后用镊子将其取出以到达耳蜗。
切除踝、胯骨和半规管。小心地取下覆盖耳蜗顶端的骨头，并用镊子划伤耳蜗骨，在顶点和基底转弯处打出小孔，或者在两个位置小心地戳孔。立即将大疱转移到至少50毫升的冷固定剂中。
要将耳蜗切成两半，请将一块长度超过耳蜗盘绕长度的剃须刀片放入刀片架中。然后，将耳蜗置于体视显微镜下的培养皿中。用剃须刀片或细剪刀切掉多余的组织。
用细镊子将耳蜗固定到位，并沿着镊子切成两半。通过将自身荧光淬灭剂与70%乙醇混合来制备5%的溶液。将大肠杆菌置于该溶液中，并在室温下在摇床上孵育一分钟，然后用一毫升PBS洗涤三次，持续五分钟。
为了解剖耳蜗，收集两个细镊子，超细镊子，叶片，弹簧剪刀，刀片支架，剃须刀片，并用PBS填充聚苯乙烯培养皿及其盖子。从剃须刀刀片上掰开碎片，以获得两到四毫米的切割表面。将耳蜗切成两半，如组织制备部分所示。
用镊子小心地固定耳蜗的一半，使切割边缘朝上。使用细弹簧剪刀切除覆盖顶端的螺旋骨上方的耳蜗骨。然后，使用剪刀通过切开莫迪奥勒和听觉神经以及 Scala 前庭来隔离顶端转弯。
在上面的耳蜗骨的每一侧进行两次切口，或者如果不需要进一步评估血管纹，则直接通过中间转弯的纹状血管。使用剃须刀片分离耳蜗碎片。或者，在皮质器官和血管纹之间切割。
将纹状血管连接到螺旋韧带，并使用镊子去除脱钙的骨。接下来，将人工耳蜗转移到装有PBS的培养皿盖中。去除柱子和磨砂面上多余的组织，以便整个支架稍后将尽可能平坦地放在载玻片上。
大的耳蜗碎片，特别是那些来自基底转弯的耳蜗碎片，应该被切成两块。用超细镊子小心地去除胸膜。将耳蜗碎片放在滑轨上，放入一滴安装介质中，确保Corti器官朝上。
将人工耳蜗移入矢状面，并在靠近内毛细胞的地方寻找螺旋边缘的内陷。螺旋边缘的这种内陷在中耳蜗和基底耳蜗碎片中可以更清楚地看到。通过重复这些步骤将整个耳蜗和整个血管纹转移到显微镜载玻片上。
盖上滑轨，并在边缘周围添加黑色指甲油以进行密封。在黑暗中干燥，并将其储存在四摄氏度。在装有BioVoxxel插件的ImageJ软件中打开反卷积堆栈的副本。
通过单击"图像"、"颜色"和"拆分通道"来拆分通道。通过单击"图像"，然后单击"颜色"，然后单击"合并通道"以分配不同的颜色来合并它们。通过单击"图像"将图像转换为 RGB 堆栈，然后转到"颜色"并单击"堆栈到 RGB"。
通过单击"图像"，"调整"，然后单击"亮度/对比度"来调整亮度和对比度。使用自动或滑块来确保突触前后结构和内部毛细胞标签与背景不同。使用文本工具标记五个内部毛发单元，方法是单击堆栈中的所需位置。
接下来，转到"分析"，然后转到"工具"，然后选择"ROI 管理器"。选中复选框标签以使用数字标记点。放大感兴趣的内部毛细胞。
右键单击点工具以选择多点模式。滚动浏览 Z 维度并计算功能性带状突触，这些突触突触前突触突触带状突触突触后谷氨酸贴片并置以识别。选择所有感兴趣的结构后，单击添加 ROI 管理器，然后单击任意名称并选择重命名。
使用手动工具，调整图像以完全显示下一个内部毛细胞。从多点工具更改为点工具，以避免向以前存储的数据添加更多点符号。单击下一个内部毛细胞中的感兴趣结构，然后更改为多点工具。
继续在ROI管理器中添加功能性色带突触，直到评估所有内部毛细胞。单击 ROI 管理器中的数据集，然后单击"度量"。等待出现列出测量数据点的新窗口，然后单击"文件"和"另存为"以将此列表另存为电子表格。
通过在 ROI 管理器中激活"全部显示"来保存图像。单击"展平"以将点标签永久添加到堆栈，然后单击"同意"以通过保存更改来关闭。来自10个月龄的年轻沙鼠耳蜗的Z堆栈投影显示，这里由白色虚线勾勒的肌球蛋白7A标记的内毛细胞与背景形成鲜明对比。
突触前的带标有绿色的抗CtBP2二，突触后的谷氨酸贴片标有红色的抗GluA2。来自38个月大的老沙鼠的耳蜗用自发荧光淬灭剂处理，并显示出明显的内部毛细胞，具有清晰可见的突触前和突触后结构。为了测试免疫标记的稳定性，在三个月和29 1/2个月后对来自年轻沙鼠的同一块耳蜗进行成像。
尽管信噪比降低，但功能突触是不同的和可量化的。即使切口失败，也要安装剩余的组织片，以便以后最准确地估计整个耳蜗长度。如果先于电生理或心理物理听力测试，然后单独与该协议中的数据相关联，则该协议的数据特别有价值。
