集体细胞迁移通常由信号分子的梯度引导。在此视频中，我们将演示如何在生化梯度指导下的集体迁移过程中量化细胞力。因此，我们将微流体芯片与牵引显微镜集成，然后使用微流体芯片产生生化梯度，并使用牵引显微镜测量细胞力。
我实验室的研究生张焕世博士将演示这个程序。通过将基弹性体和固化剂混合在一起，以 1 比 1 的比例准备 PDMS 解决方案。将15毫升的基弹性体放在50毫升锥形管中，并加入1.5毫升固化剂。
准备其中两个管子。在196次g离心时旋转PDMS混合物5分钟，然后离心1分钟，去除气泡。要制造 PDMS 模具，请将大约 1 毫升的 PDMS 混合物倒在晶圆上，同时避免 SU-8 型区域，使 PDMS 接触 SU-8 柱的一侧，而不是 SU-8 模式的顶部。
在室温下将晶圆放在平坦表面上超过 30 分钟，然后在 80 摄氏度的干烤箱中固化 PDMS 超过两个小时。小心地从 SU-8 模具中剥离 PDMS，使用 14 毫米空心冲孔修剪薄的 PDMS 膜。在高压灭菌 PDMS 模具之前，使用胶带清除 PDMS 模具表面的灰尘。
要制造 PDMS 微通道，将大约 30 毫升 PDMS 混合物倒在 SU-8 模具上。在真空室中脱气30分钟，然后在80摄氏度的干烤箱中固化PDMS两个多小时。小心地从 SU-8 模具中剥离 PDMS，将 PDMS 切割至 24 毫米的尺寸，24 毫米。
在每个 PDMS 块中，使用一毫米活检冲头创建一个出口和三个入口。按照文本协议中所述，制造和硅化玻璃幻灯片。用 100 微升的粘合硅烷溶液覆盖底部玻璃的边缘表面。
将玻璃在室温下离开一小时后，用去维水冲洗玻璃三次。然后让玻璃在环境空气温度下干燥或吹压缩空气。准备文本协议中描述的聚丙烯酰胺凝胶溶液。
然后将 10 微升混合凝胶溶液转移到矩形微孔上，并在顶部放置圆形盖滑。用胶带将定制玻璃、凝胶溶液和盖滑粘在六井板的盖上，然后翻转。然后在96倍g下离心10分钟，将荧光颗粒带到聚丙烯酰胺凝胶的顶层。
从离心机上拆下组件，并将其放在平坦的表面上，盖板朝下。30 分钟后，翻转组件并放在 35 毫米培养皿中。用两毫升的去化水填满盘子。
使用钳子，轻轻拆下盖滑，将其滑到一侧。要编码聚丙烯酰胺凝胶上的胶原蛋白，在温暖的50毫摩尔 HEPES 缓冲液中溶解每毫升磺胺-SANPAH 1毫克。将溶液的 200 微升滴到凝胶表面，通过紫外线激活 10 分钟。
紫外线激活后，用0.1摩尔 HEPES 缓冲液冲洗凝胶两次，然后用 PBS 冲洗一次。在四摄氏度下将聚丙烯酰胺凝胶编码为四摄氏度的胶原蛋白溶液。第二天，用PBS清洗凝胶三次。
将自动解自保存的 PDMS 模具浸入 F-127 解决方案中。在37摄氏度的孵化器中保持一小时。用 PBS 清洗 PDMS 模具三次，从 PDMS 模具和聚丙烯酰胺凝胶中去除液体。
然后将 PDMS 模具放在聚丙烯酰胺凝胶上，并将 PBS 添加到模具中。通过轻轻移液，去除 PDMS 模具孔中的气泡。清除气泡后，从 PDMS 模具表面清除 PBS。
现在，将200微升的细胞溶液添加到PDMS模具中，并将凝胶放在培养箱中一小时，使细胞附着在聚丙烯酰胺凝胶上。孵育后，用细胞培养培养培养膜轻轻洗去细胞溶液，并添加更多细胞培养培养。取出 PDMS 模具，在显微镜下检查细胞孤岛的形成。
接下来，用氧等离子体处理PDMS微通道的表面30秒。去除聚丙烯酰胺凝胶填充底玻璃上的任何液体后，将 PDMS 微通道放在底部玻璃的顶部，然后将组件放在定制玻璃支架上。用细胞培养培养库填充微通道。
要准备集成微流体系统的进气管，请将修剪的针头和 30 厘米的迷你体积线与三向插管连接。准备其中三项安排。对于出口管，连接修剪的针和 75 厘米的迷你卷线与三向插管。
用预热一小时的介质填充管材管通过从注射器中拆下柱塞并连接进气管管线来准备储液罐。将每根管材线的针接头插入微流体装置的三个进气口和一个出口。
在每个储液罐中填充三毫升的新鲜介质或有条件介质。对于梯度测试，在细胞培养基中，用每毫升肝细胞生长因子（或HGF）填充左入口储层20毫微克。为了可视化浓度梯度，每毫升荧光染料向左侧进气罐中添加 200 微克。
将出口管管管管管线连接到注射器泵。将集成的微流体系统放在传统荧光显微镜的舞台上。使用安装在培养箱中的自动显微镜，每 10 分钟拍摄一次图像，长达 24 小时。
在每个时间点，使用三个不同通道的 4 倍客观透镜拍摄一组图像，包括用于可视化细胞迁移的相位图像、用于可视化凝胶中嵌入的荧光珠的绿色荧光图像以及用于可视化化学品浓度梯度的红色荧光图像。拍摄延时图像后，将0.25%的 Trypsin-EDTA 溶液注入微通道，将细胞从聚丙烯酰胺凝胶中分离出来。从凝胶中完全去除细胞后，拍摄绿色荧光图像作为牵引显微镜的参考图像。
按照文本协议中所述进行数据分析。为了测量收缩力和细胞间应力，将牵引显微镜和单层应力显微镜与微流体通道相结合。地图是用暖色和向内牵引力在无线电协调下绘制的，使用冷色。
在零时，所有岛屿都表现出类似的牵引力分布，在边缘有很强的内向牵引力，在岛屿内波动。应用HGF梯度10小时后，虽然每列的岛扩张程度不同，但牵引力分布与时间零大体相似。平均牵引力10小时未改变。
但是，在计算单层应力时，每列都显示了不同的趋势。在HGF浓度低的地方，在10小时内，岛屿内的平均张力保持在200帕斯卡左右。如先前所示，在HGF浓度高的地方，岛屿内的平均张力在10小时内从230帕斯卡逐渐减少到100帕斯卡。
其中HGF浓度在岛的左半部分高，在岛的右半部分较低，平均张力维持在150帕斯卡左右。填充微流体通道必须温和。重要的是要去除被困在通道中的气泡，同时不破坏微型母细胞岛。
通过使用这个集成系统，可以研究细胞集体如何机械地对各种化学梯度作出反应，如化疗吸引剂或生长因子。该平台将帮助我们进一步探索化学梯度下集体细胞迁移的机制，这是了解再生、癌症转移和发展的关键。
