La migrazione collettiva delle cellule è spesso guidata dal gradiente delle molecole di segnalazione. In questo video, dimostriamo come quantificare le forze cellulari durante la migrazione collettiva guidata dal gradiente biochimico. Quindi integriamo il chip microfluidico con la microscopia a trazione, poi usiamo il chip microfluidico per generare gradiente biochimico, e usiamo la microscopia di trazione per misurare la forza cellulare.
Il dottor Hwanseok Jang, un post-laurea nel mio laboratorio, dimostrerà la procedura. Preparare la soluzione PDMS mescolando l'elastomero di base e l'agente polimerizzante con un rapporto di dieci a uno. Posizionare 15 millilitri dell'elastomero di base in un tubo conico da 50 millilitri e aggiungere 1,5 millilitri di agente polimerizzante.
Preparare due di questi tubi. Vortice la miscela PDMS per cinque minuti prima di centrifugare a 196 g per un minuto per rimuovere le bolle. Per fabbricare lo stencil PDMS, versare circa un millilitro della miscela PDMS sul wafer evitando regioni a motivi SU-8 in modo che il PDMS tocchi il lato dei pilastri SU-8 ma non la parte superiore del modello SU-8.
Posizionare il wafer su una superficie piana per oltre 30 minuti a temperatura ambiente, quindi polimerizzarlo in un forno asciutto a 80 gradi Celsius per oltre due ore. Staccare con cura il PDMS dallo stampo SU-8, tagliare la sottile membrana PDMS utilizzando un punzone cavo di 14 millimetri. Rimuovere la polvere sulla superficie dei pezzi PDMS utilizzando nastro adesivo prima di autoclavare gli stencil PDMS.
Per fabbricare il microcanale PDMS, versare circa 30 millilitri di miscela PDMS sopra lo stampo SU-8. Degasare per 30 minuti in una camera a vuoto, quindi curare il PDMS in un forno asciutto a 80 gradi Celsius per oltre due ore. Staccare con cura il PDMS dallo stampo SU-8 e tagliare il PDMS a una dimensione di 24 millimetri per 24 millimetri.
In ogni blocco PDMS, creare una presa e tre insenature utilizzando un punzone di biopsia di un millimetro. Fabbricazione e silanizzazione di diapositive di vetro come descritto nel protocollo di testo. Coprire la superficie bordata del vetro inferiore con 100 microlitri della soluzione bind-silane.
Dopo aver lasciato il bicchiere a temperatura ambiente per un'ora, sciacquare il bicchiere tre volte con acqua deionizzata. Quindi lasciare asciugare il vetro a temperatura ambiente o soffiando aria compressa. Preparare la soluzione di gel di poliacrilammide come descritto nel protocollo di testo.
Quindi trasferire per 10 microlitri di soluzione di gel misto sul microwell rettangolare e posizionare un coperchio circolare scivolare sopra. Fissare l'assemblaggio di vetro personalizzato, soluzione di gel e coperchio scivolare sul coperchio di una piastra a sei po 'con nastro adesivo e capovolgerlo. Quindi centrifugare per 10 minuti a 96 volte g per portare particelle fluorescenti allo strato superiore del gel di poliacrilammide.
Rimuovere l'assieme dalla centrifuga e posizionarlo su una superficie piana con lo slittamento del coperchio rivolto verso il basso. Dopo 30 minuti, capovolgere l'assieme e posizionarlo in una piastra di Petri di 35 millimetri. Riempire il piatto con due millilitri di acqua deionizzata.
Utilizzando le forcep, rimuovere delicatamente lo scivolamento del coperchio facendolo scorrere su un lato. Per codificare il collagene sul gel di poliacrilammide, sciogliere un milligrammo per millilitro sulfo-SANPAH in un caldo tampone HEPES da 50 millimolare. Far cadere 200 microlitri della soluzione sulla superficie del gel e attivarli con la luce UV per 10 minuti.
Dopo l'attivazione UV, sciacquare il gel due volte con tampone HEPES molare 0.1 e quindi una volta con PBS. Codificare il gel di poliacrilammide con soluzione di collagene a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, lavare il gel tre volte con PBS.
Immergere lo stencil PDMS autoclavato nella soluzione F-127. Tienilo in un incubatore Celsius di 37 gradi per un'ora. Lavare lo stencil PDMS con PBS tre volte e rimuovere il liquido dallo stencil PDMS e dal gel di poliacrilammide.
Quindi posizionare lo stencil PDMS sul gel di poliacrilammide e aggiungere PBS allo stencil. Rimuovere le bolle nei fori dello stencil PDMS tubazionando delicatamente. Dopo aver rimosso le bolle, cancellare il PBS dalla superficie dello stencil PDMS.
Ora aggiungi 200 microlitri della soluzione cellulare sullo stencil PDMS e posiziona il gel in un'incubatrice per un'ora in modo che le cellule si attaccano al gel di poliacrilammide. Dopo l'incubazione, lavare delicatamente la soluzione cellulare con mezzi di coltura cellulare e aggiungere più mezzi di coltura cellulare. Rimuovere lo stencil PDMS, controllare la formazione di isole cellulari al microscopio.
Quindi, trattare la superficie del microcanale PDMS con plasma di ossigeno per 30 secondi. Dopo aver rimosso qualsiasi fluido sul vetro inferiore pieno di gel di poliacrilammide, posizionare il microcanale PDMS sopra il vetro inferiore e mettere l'assemblaggio sul supporto di vetro personalizzato. Riempire il microcanale con il mezzo di coltura cellulare.
Per preparare il tubo di ingresso del sistema microfluidico integrato, collegare un ago tagliato e una linea di mini volume di 30 centimetri con un fermagli a tre. Preparare tre di questi accordi. Per i tubi di uscita, collegare un ago tagliato e una linea mini volume di 75 centimetri con un fermagli a tre.
Riempire le linee di tubi con il mezzo che è stato preriscaldato per un'ora. Preparare i serbatoi rimuovendo i pistoni dalle siringhe e collegando le linee di tubi di ingresso. Collegare i connettori dell'ago di ogni linea di tubi alle tre entrate e a una presa del dispositivo microfluidico.
Riempire ogni serbatoio con tre millilitri di mezzo fresco o mezzo condizionato. Per il test del gradiente, riempire il serbatoio di ingresso sinistro con 20 nanogrammi per fattore di crescita di epatociti millilitro, o HGF, nel mezzo di coltura cellulare. Per la visualizzazione del gradiente di concentrazione, aggiungere 200 microgrammi per millilitro di colorante fluorescente al serbatoio di ingresso sinistro.
Collegare la linea di tubi di uscita a una pompa per siringhe. Posizionare il sistema microfluidico integrato sullo stadio di un microscopio epifluorescente convenzionale. Scatta immagini ogni 10 minuti per un massimo di 24 ore utilizzando un microscopio automatizzato alloggiato in un incubatore.
In ogni momento, scatta una serie di immagini usando un obiettivo 4X in tre canali diversi, tra cui un'immagine di fase per visualizzare la migrazione cellulare, un'immagine fluorescente verde per visualizzare le perline fluorescenti incorporate nel gel e un'immagine fluorescente rossa per visualizzare il gradiente di concentrazione di una sostanza chimica. Dopo aver scattato immagini time-lapse, infondere la soluzione 0.25%Trypsin-EDTA in microcanali per staccare le cellule dal gel di poliacrilammide. Dopo aver rimosso completamente le cellule dal gel, prendi un'immagine fluorescente verde da utilizzare come immagine di riferimento per la microscopia a trazione.
Procedere all'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo. Per misurare la forza contrattile e lo stress intercellulare, la microscopia a trazione e la microscopia a sollecitazione monostrato sono state combinate con il canale microfluidico. Le mappe sono state tracciate in coordinazione radio con trazione esterna utilizzando colore caldo e trazione verso l'interno usando il colore freddo.
Al tempo zero, tutte le isole mostravano distribuzioni di trazione simili con una forte trazione verso l'interno sul bordo e fluttuazione all'interno dell'isola. Dopo 10 ore di applicazione del gradiente HGF, mentre il grado di espansione dell'isola era diverso in ogni colonna, le distribuzioni di trazione erano in gran parte simili al tempo zero. La trazione media non è stata modificata per 10 ore.
Nel calcolare la sollecitazione monostrato, tuttavia, ogni colonna ha mostrato tendenze diverse. Dove la concentrazione di HGF era bassa, la tensione media all'interno delle isole è stata mantenuta intorno ai 200 pascal per un periodo di 10 ore. Dove la concentrazione di HGF era alta, la tensione media all'interno delle isole è gradualmente diminuita da 230 pascal a 100 pascal in 10 ore, come mostrato in precedenza.
Dove la concentrazione di HGF era alta sulla metà sinistra e bassa sulla metà destra dell'isola, la tensione media è stata mantenuta intorno ai 150 pascal. Riempire il canale microfluidico deve essere delicato. È importante rimuovere le bolle intrappolate nel canale senza interrompere contemporaneamente le isole micro-cellulari madri.
Utilizzando questo sistema integrato, si può indagare su come il collettivo cellulare risponda meccanicamente a vari gradienti chimici, come attrattivi chemio o fattori di crescita. Questa piattaforma ci aiuterà a esplorare ulteriormente la meccanica della migrazione cellulare collettiva sotto gradienti chimici, che è la chiave per comprendere la rigenerazione, la metastasi del cancro e lo sviluppo.
