Kolektif hücre göçü genellikle sinyal moleküllerinin degradesi tarafından yönlendirilir. Bu videoda, biyokimyasal gradyan rehberliğinde kolektif göç sırasında hücresel kuvvetlerin nasıl ölçültüldebileceğimizi gösteriyoruz. Mikroakışkan çipi çekiş mikroskobuyla bütünleştiriyoruz, sonra biyokimyasal gradyan üretmek için mikroakışkan çipi kullanıyoruz, ve hücresel kuvveti ölçmek için çekiş mikroskobu kullanıyoruz.
Dr.Hwanseok Jang, laboratuvarımda bir lisans üstü, prosedürü gösterecek. PDMS çözeltisini baz elastomerve kür ajanını on'a bir oranında karıştırarak hazırlayın. 50 mililitrelik konik bir tüpe 15 mililitre baz elastomer yerleştirin ve 1,5 mililitre kür leme maddesi ekleyin.
Bu tüplerden iki tane hazırlayın. Girdap pdms karışımı beş dakika önce 196 zaman g bir dakika kabarcıklar kaldırmak için santrifüj. PDMS şablonu imal etmek için, PDMS'nin SU-8 sütunlarının kenarına değmesi için SU-8 desenli bölgelerden kaçınırken gofrete yaklaşık bir mililitre PDMS karışımı dökün, böylece SU-8 deseninin üst kısmına değmez.
Oda sıcaklığında 30 dakikadan fazla düz bir yüzeye gofret yerleştirin, sonra iki saat boyunca 80 santigrat derece kuru bir fırında PDMS tedavi. SU-8 kalıbından PDMS'yi dikkatlice soyun, ince PDMS membranını 14 milimetrelik içi boş bir zımba kullanarak kırpın. PDMS şablonlarını otomatik olarak takmadan önce yapışkan bant kullanarak PDMS parçalarının yüzeyindeki tozu çıkarın.
PDMS mikrokanalını imal etmek için, SU-8 kalıbının üzerine yaklaşık 30 mililitre PDMS karışımı dökün. Bir vakum odasında 30 dakika degas ve sonra iki saat boyunca 80 santigrat derece kuru bir fırında PDMS tedavi. SU-8 kalıbından PDMS'yi dikkatlice soyun ve PDMS'yi 24 milimetre boyutuna kadar kesin.
Her PDMS bloğunda, bir milimetrelik biyopsi yumruğu kullanarak bir çıkış ve üç giriş oluşturun. Metin protokolünde açıklandığı gibi cam slaytlar üretin ve silanize edin. Alt camın kenarlı yüzeyini 100 mikrolitre bağlayıcı-silane çözeltisi ile kapatın.
Camdan oda sıcaklığında bir saat çıktıktan sonra, bardağı üç kez deiyonize suyla durulayın. Daha sonra cam ortam hava sıcaklığında veya basınçlı hava üfleme tarafından kurumasına izin verin. Metin protokolünde açıklandığı gibi poliakrilamid jel çözeltisini hazırlayın.
Daha sonra 10 mikrolitre karışık jel çözeltisi için dikdörtgen mikrokuyuya aktarın ve üzerine dairesel bir kapak fişi yerleştirin. Özel cam, jel çözeltisi montaj sabitleyin ve yapışkan bant ile altı iyi bir plaka kapağında kapak kayma ve çevirin. Sonra poliakrilamid jel üst tabakasıfloresan parçacıklar getirmek için 96 kez g 10 dakika santrifüj.
Tertibatı santrifüjden çıkarın ve kapak kayma aşağı bakacak şekilde düz bir yüzeye yerleştirin. 30 dakika sonra, montaj çevirin ve 35 milimetrelik Petri kabına yerleştirin. İki mililitre deiyonize su ile çanak doldurun.
Forceps kullanarak, bir tarafa kaydırarak kapağı hafifçe çıkarın. Poliakrilamid jel üzerinde kollajen kod için, sıcak bir 50 milimolar HEPES tampon mililitre sulfo-SANPAH başına bir miligram çözün. Çözeltinin 200 mikrolitresini jel yüzeyine bırakın ve UV ışığı yla 10 dakika aktif hale getirin.
UV aktivasyonundan sonra jeli 0.1 molar HEPES tamponuyla iki kez durulayın ve sonra pbs ile bir kez durulayın. Bir gecede kollajen çözeltisi ile poliakrilamid jel kod. Ertesi gün jeli PBS ile üç kez yıkayın.
Otoklavlı PDMS şablonunu F-127 çözeltisindeki batırın. Bir saat boyunca 37 derecelik bir kantinde saklayın. PDMS şablonunu PBS ile üç kez yıkayın ve hem PDMS şablonundan hem de poliakrilamid jelden sıvı yıkayın.
Sonra poliakrilamid jel üzerine PDMS şablon yerleştirin ve şablona PBS ekleyin. PDMS şablonunun deliklerinde yavaşça boru lar atarak kabarcıkları çıkarın. Kabarcıkları çıkardıktan sonra PBS'yi PDMS şablonunun yüzeyinden temizleyin.
Şimdi PDMS şablon üzerine hücre çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin ve hücreleri poliakrilamid jel eklemek böylece bir saat boyunca bir kuvöz jel yerleştirin. Kuluçkadan sonra, hücre çözümlü hücre çözümlerini hücre kültürü ortamıyla hafifçe yıkayın ve daha fazla hücre kültürü ortamı ekleyin. PDMS şablonunu çıkarın, mikroskop altında hücre adalarının oluşumunu kontrol edin.
Daha sonra, 30 saniye boyunca oksijen plazması ile PDMS mikrokanal yüzeyini tedavi edin. Poliakrilamid jel dolu alt cam üzerinde herhangi bir sıvı çıkardıktan sonra, alt cam üstüne PDMS mikrokanal yerleştirin ve özel cam tutucu montaj koymak. Mikro kanalı hücre kültürü ortamıyla doldurun.
Entegre mikroakışkan sistemin giriş borularını hazırlamak için kesilmiş bir iğneyi ve 30 santimetrelik mini hacim hattını üç yönlü stopcock ile bağlayın. Bu düzenlemelerden üçünü hazırlayın. Çıkış borusu için, kesilmiş bir iğneyi ve 75 santimetrelik mini hacim hattını üç yönlü stopcock ile bağlayın.
Boru hatlarını bir saat önceden ısıtılmış ortamla doldurun. Şırıngalardan dalan ve giriş boru hatlarını birbirine bağlayarak rezervuarları hazırlayın. Her boru hattının iğne konektörlerini üç girişe ve mikroakışkan cihazın bir çıkışına takın.
Her rezervuarı üç mililitre taze orta veya şartlı ortamla doldurun. Degrade testi için, hücre kültürü orta mililitre hepatosit büyüme faktörü veya HGF başına 20 nanogram ile sol giriş rezervuardoldurun. Konsantrasyon gradyanının görselleştirilmesi için, sol giriş haznesine floresan boyanın mililitresine 200 mikrogram ekleyin.
Çıkış boru hattını şırınga pompasına bağlayın. Entegre mikroakışkan sistemi geleneksel epifloresan mikroskobun sahnesine yerleştirin. Bir kuluçka makinesinde bulunan otomatik bir mikroskop kullanarak 24 saate kadar her 10 dakikada bir fotoğraf çekin.
Her zaman noktasında, hücre geçişini görselleştirmek için bir faz görüntüsü, jelin içine gömülü floresan boncukları görselleştirmek için yeşil floresan görüntü ve bir kimyasalın konsantrasyon gradyanını görselleştirmek için kırmızı floresan görüntü dahil olmak üzere üç farklı kanalda 4X nesnel lens kullanarak bir dizi görüntü alın. Hızlandırılmış görüntüler aldıktan sonra, poliakrilamid jel hücreleri ayırmak için mikrokanallar içine% 0.25 Tripsin-EDTA çözeltisi infüzyon. Jel hücreleri tamamen çıkardıktan sonra, çekiş mikroskopisi için bir referans görüntü olarak kullanılmak üzere yeşil floresan görüntü almak.
Metin protokolünde açıklandığı gibi veri analizine devam edin. Kontraktil kuvvet ve hücreler arası stresi ölçmek için traksiyon mikroskobu ve monolayer stres mikroskobu mikroakışkan kanalla birleştirilmiştir. Haritalar, sıcak renk ve soğuk renk kullanılarak içe doğru çekiş kullanılarak dışa çekiş ile radyo koordinasyonu nda çizilmiştir.
Zaman sıfır, tüm adalar kenarında güçlü içe çekiş ve ada içinde dalgalanma ile benzer çekiş dağılımları gösterdi. HGF degradesi uygulandıktan sonra 10 saat sonra, ada genişleme derecesi her sütunda farklı iken, çekiş dağılımları büyük ölçüde zaman sıfır benzerdi. Ortalama çekiş 10 saat boyunca değişmedi.
Ancak, tek katmanlı stres hesaplanırken, her sütun farklı eğilimler gösterdi. HGF konsantrasyonu düşük olduğu yerlerde, adalar içindeki ortalama gerginlik 10 saatlik bir süre boyunca yaklaşık 200 pascal olarak korundu. HGF konsantrasyonu yüksek olduğu yerlerde, adalar içindeki ortalama gerilim daha önce gösterildiği gibi, 10 saat içinde 230 pascal'dan 100 pascal'a kademeli olarak azaldı.
HGF konsantrasyonunun adanın sağ yarısında sol yarısında yüksek ve düşük olduğu yerde, ortalama gerginlik 150 pascal civarında tutuldu. Mikroakışkan kanalı doldurmak nazik olmalıdır. Aynı anda mikro ana hücre adaları bozmazken kanalda sıkışıp kabarcıklar kaldırmak için önemlidir.
Bu entegre sistemi kullanarak, hücre kolektifinin kemo çekiciler veya büyüme faktörleri gibi çeşitli kimyasal degradelere mekanik olarak nasıl tepki verdiği araştırılabilir. Bu platform, yenilenmeyi, kanser metastazını ve gelişimini anlamanın anahtarı olan kimyasal degradeler altında kolektif hücre göçünün mekaniğini daha fazla keşfetmemize yardımcı olacaktır.
