집단 세포 이동은 종종 신호 분자의 그라데이션에 의해 유도됩니다. 이 비디오에서는 생화학 적 그라데이션에 의해 유도되는 집단 이동 중에 세포력을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 그래서, 우리는 견인 현미경 검사법과 미세 유체 칩을 통합, 우리는 생화학 적 그라데이션을 생성하기 위해 미세 유체 칩을 사용하고, 우리는 세포 힘을 측정하기 위해 견인 현미경 을 사용합니다.
내 실험실에서 포스트라드인 장환석 박사가 그 절차를 시연할 예정이다. 기본 탄성 중합체 및 경화제를 10 대 1의 비율로 혼합하여 PDMS 솔루션을 준비하십시오. 50 밀리리터 원내 튜브에 베이스 엘라스토머 15밀리리터를 넣고 1.5 밀리리터의 경화제를 추가합니다.
이 튜브 중 두 개를 준비합니다. 196 시간 g에서 원심분리하기 전에 5 분 동안 PDMS 혼합물을 소용돌이하여 거품을 제거합니다. PDMS 스텐실을 제조하려면, PDMS가 SU-8 기둥의 측면에 닿지 않도록 SU-8 패턴 영역을 피하면서 웨이퍼에 PDMS 혼합물의 약 1 밀리리터를 부어 주어 그러나 SU-8 패턴의 상단은 아닙니다.
실온에서 30분 이상 평평한 표면에 웨이퍼를 놓고 2시간 이상 섭씨 80도의 건조한 오븐에서 PDMS를 치료합니다. SU-8 금형에서 PDMS를 조심스럽게 벗겨내고 14mm 중공 펀치를 사용하여 얇은 PDMS 멤브레인을 다듬습니다. PDMS 스텐실을 오토클레이브하기 전에 스티커 테이프를 사용하여 PDMS 조각 표면의 먼지를 제거합니다.
PDMS 마이크로 채널을 제작하려면 SU-8 금형에 약 30 밀리리터의 PDMS 혼합물을 붓습니다. 진공 챔버에서 30 분 동안 가스를 드린 다음 2 시간 이상 섭씨 80도에서 건조한 오븐에서 PDMS를 치료하십시오. SU-8 금형에서 PDMS를 조심스럽게 벗겨내고 PDMS를 24mm 크기로 24밀리미터 로 자른다.
각 PDMS 블록에서 1mm 생검 펀치를 사용하여 콘센트 1개와 3개의 입구를 만듭니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유리 슬라이드를 제조하고 격리합니다. 바인드 시레인 용액의 100 마이크로리터로 아래 유리의 가장자리 표면을 덮습니다.
1 시간 동안 실온에서 유리를 떠난 후, 탈이온 된 물로 유리를 세 번 헹구는 다. 그런 다음 유리가 주변 공기 온도에서 또는 압축 공기를 불어 건조하게하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 폴리아크릴아미드 젤 용액을 준비한다.
그런 다음 혼합 젤 용액 10 마이크로리터를 직사각형 마이크로웰에 옮기고 원형 커버 슬립을 위에 놓습니다. 사용자 정의 유리, 젤 용액의 조립을 고정하고, 끈적 끈적한 테이프로 6 웰 플레이트의 표지에 커버 슬립을 고정하고 뒤집습니다. 그런 다음 원심분리기는 96배 g에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 형광 입자를 폴리아크릴아미드 젤의 상부 층으로 가져옵니다.
원심분리기에서 어셈블리를 제거하고 덮개 가느리를 아래로 향하여 평평한 표면에 놓습니다. 30분 후 조립을 뒤집어 35mm 페트리 접시에 놓습니다. 식수 2밀리리터로 접시를 채웁니다.
집게를 사용하여 커버 슬립을 한쪽으로 밀어 부드럽게 제거합니다. 폴리아크릴아미드 젤에 콜라겐을 코딩하려면 밀리리터 설포-SANPAH당 1밀리그램을 따뜻한 50밀리마일헤르 HEPES 버퍼에 녹입니다. 용액 200마이크로리터를 젤 표면에 떨어뜨리고 UV 광으로 10분 동안 활성화합니다.
UV 활성화에 따라 0.1 대구 헤페스 버퍼로 젤을 두 번 헹구고 PBS로 한 번 헹구는 다. 하룻밤 사이에 콜라겐 용액으로 폴리아크릴아미드 젤을 코드로 보관하십시오. 다음 날, PBS로 젤을 세 번 씻으시면 됩니다.
F-127 솔루션에 오토클레이브 PDMS 스텐실을 침수합니다. 섭씨 37도 인큐베이터에 1시간 동안 보관하십시오. PDMS 스텐실을 PBS로 세 번 세척하고 PDMS 스텐실과 폴리아크릴아미드 젤 모두에서 액체를 제거합니다.
그런 다음 PDMS 스텐실을 폴리아크릴아미드 젤에 놓고 스텐실에 PBS를 추가합니다. 부드럽게 파이프를 통해 PDMS 스텐실 구멍의 거품을 제거합니다. 거품을 제거한 후 PDMS 스텐실 표면에서 PBS를 지웁울 수 있습니다.
이제 세포 용액의 200 마이크로리터를 PDMS 스텐실에 추가하고 세포가 폴리 아크릴아미드 젤에 부착되도록 1 시간 동안 인큐베이터에 젤을 배치합니다. 인큐베이션에 따라 세포 배양 배지로 세포 용액을 부드럽게 씻어 내고 세포 배양 매체를 더 추가합니다. PDMS 스텐실을 제거하고 현미경으로 세포 섬의 형성을 확인하십시오.
다음으로, 30초 동안 PDMS 마이크로채널의 표면을 산소 플라즈마로 처리한다. 폴리아크릴아미드 젤로 채워진 바닥 유리상의 유체를 제거한 후, PDMS 마이크로채널을 하단 유리 위에 놓고 맞춤형 유리 홀더에 어셈블리를 놓습니다. 세포 배양 배지로 마이크로채널을 채웁니다.
통합 된 미세 유체 시스템의 입구 튜브를 준비하려면 트리밍 된 바늘과 30 센티미터 미니 볼륨 라인을 3 방향 스톱콕과 연결합니다. 이러한 준비 중 세 가지를 준비합니다. 아울렛 튜빙의 경우, 트리밍 된 바늘과 75 센티미터 미니 볼륨 라인을 3 방향 스톱콕과 연결하십시오.
튜브 라인을 1시간 동안 예열된 매체로 채웁니다. 주사기에서 플런거를 제거하고 입구 튜브 라인을 연결하여 저수지를 준비합니다. 각 튜브 라인의 바늘 커넥터를 미세 유체 장치의 세 개의 입구와 하나의 콘센트에 연결합니다.
각 저장소에 신선한 중간 또는 조건된 매체의 3밀리리터를 채웁니다. 그라데이션 테스트를 위해, 좌측 입구 저장소를 밀리리터 간세포 성장 인자, 또는 HGF당 20 나노그램으로 채우는 세포 배양 배지에 있다. 농도 그라데이션의 시각화를 위해 왼쪽 입구 저장소에 형광 염료밀리리터 당 200 마이크로그램을 추가합니다.
콘센트 튜빙 라인을 주사기 펌프에 연결합니다. 기존의 상피 현미경의 단계에 통합 된 미세 유체 시스템을 배치합니다. 인큐베이터에 보관된 자동화된 현미경을 사용하여 최대 24시간 동안 10분마다 이미지를 찍습니다.
매 번 세포 이동을 시각화하는 상 영상, 젤에 내장된 형광구를 시각화하는 녹색 형광화상, 화학 물질의 농도 그라데이션을 시각화하는 적색 형광 화상 등 3개의 다른 채널에서 4X 목표 렌즈를 사용하여 일련의 이미지를 취합니다. 시간 경과 영상을 촬영한 후 0.25%의 트립신-EDTA 용액을 마이크로 채널에 주입하여 폴리아크릴라미드 젤에서 세포를 분리합니다. 젤에서 세포를 완전히 제거하면 녹색 형광 이미지를 사용하여 견인력 현미경 검사법을 위한 기준 이미지로 사용하십시오.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 진행합니다. 수축력과 세포간 스트레스를 측정하기 위해 견인 현미경 검사법과 단층 스트레스 현미경 검사법은 미세 유체 채널과 결합되었습니다. 지도는 차가운 색상을 사용하여 따뜻한 색상과 안쪽 견인을 사용하여 외부 견인과 라디오 조정에 플롯되었다.
제로 시, 모든 섬은 가장자리에 강한 내부 견인과 섬 내에서 변동유사한 견인 분포를 보였다. 후 10 HGF 그라데이션을 적용 의 시간, 섬 확장의 정도는 각 열에서 다른 동안, 견인 분포는 주로 시간 제로와 유사했다. 평균 견인력은 10시간 동안 변경되지 않았습니다.
그러나 단층 응스트레스를 계산할 때 각 열은 서로 다른 추세를 보였습니다. HGF 농도가 낮은 곳, 섬 내평균 긴장 주위 유지 되었다 200 10 시간 기간 동안 파스칼. HGF 농도가 높았던 곳에서는 섬 내의 평균 장력이 230파스칼에서 10시간 동안 100파스칼로 점차 감소했습니다.
HGF 농도가 왼쪽 절반에 높고 섬의 오른쪽 절반에 낮은 곳, 평균 긴장 주위 유지 되었다 150 파스칼. 미세 유체 채널을 채우는 것은 온화해야합니다. 동시에 마이크로 모의 세포 섬을 방해하지 않으면서 채널에 갇혀 거품을 제거하는 것이 중요합니다.
이 통합 시스템을 사용하여 세포 집단이 화학 요법 이나 성장 인자와 같은 다양한 화학 적 그라데이션에 기계적으로 반응하는 방법을 조사 할 수 있습니다. 이 플랫폼은 재생, 암 전이 및 개발을 이해하는 열쇠인 화학 적 그라데이션하에서 집단 세포 이동의 역학을 더 탐구하는 데 도움이 될 것입니다.
