集合的細胞の移動は、シグナル伝達分子の勾配によって導かれることが多い。このビデオでは、生化学的勾配によって導かれる集団移動中に細胞の力を定量化する方法を示します。そこで、マイクロ流体チップをトラクション顕微鏡と統合し、マイクロ流体チップを使用して生化学的勾配を生成し、トラクション顕微鏡を使用して細胞力を測定します。
私の研究室のポストグラッドであるファンセク・チャン博士が手順をデモンストレーションします。10対1の比率でベースエラストマーと硬化剤を混合してPDMS溶液を調製する。ベースエラストマーの15ミリリットルを50ミリリットルの円錐チューブに入れ、1.5ミリリットルの硬化剤を加えます。
これらのチューブの2つを準備します。PDMS混合物を5分間ボルテックスしてから、196時間gで気泡を除去する1分間の遠心分離を行った。PDMSステンシルを製造するには、PDMSがSU-8ピラーの側面に触れるのではなくSU-8パターンパターンの上部に触れないように、SU-8パターンの領域を避けながら、約1ミリリットルのPDMS混合物をウエハーに注ぎます。
平らな表面に平らな表面に室温で30分以上置き、2時間以上摂氏80度の乾燥したオーブンでPDMSを治します。SU-8型からPDMSを慎重に剥がし、14ミリの中空パンチを使用して薄いPDMS膜をトリミングします。PDMSステンシルをオートクレーブする前に、粘着テープを使用してPDMSピースの表面のほこりを取り除きます。
PDMSマイクロチャネルを製造するには、約30ミリリットルのPDMS混合物をSU-8型に注ぎます。真空チャンバーで30分間脱気し、乾燥したオーブンでPDMSを摂氏80度で2時間以上硬化させます。SU-8型からPDMSを慎重に剥がし、24ミリメートルの大きさにPDMSを24ミリメートルに切ります。
各PDMSブロックで、1ミリメートルのバイオプシーパンチを使用して1つの出口と3つの入口を作成します。テキストプロトコルに記載されているように、ガラススライドを製造し、シンアナイズする。底ガラスの縁の面を100マイクロリットルのバインドシラン溶液で覆います。
ガラスを室温で1時間放置した後、ガラスを脱イオン水で3回洗い流します。その後、周囲の空気温度で、または圧縮空気を吹くことによって、ガラスを乾燥させます。テキストプロトコルに記載されているようにポリアクリルアミドゲル溶液を調製する。
その後、10マイクロリットルの混合ゲル溶液を長方形のマイクロウェルに移し、円形のカバースリップを上に置きます。カスタムガラス、ゲル溶液、カバースリップの組み立てを粘着テープで6ウェルプレートのカバーに固定し、それを反転させます。次いで96回gで10分間遠心分離機を用いて、ポリアクリルアミドゲルの最上層に蛍光粒子を持ち込んだ。
遠心分離機からアセンブリを取り外し、カバースリップを下に向けた平らな面に置きます。30分後、アセンブリを反転し、35ミリメートルのペトリ皿に入れます。2ミリリットルの脱イオン水で皿を満たします。
鉗子を使用して、カバースリップを片側にスライドさせてそっと取り外します。ポリアクリルアミドゲルにコラーゲンをコードするには、1ミリリットルのスルホ-SANPAHあたり1ミリグラムを暖かい50ミリモルHEPESバッファーに溶解します。200マイクロリットルの溶液をゲル表面に落とし、UV光で10分間活性化します。
UV活性化後、ゲルを0.1モルHEPESバッファーで2回リンスし、次にPBSで1回リンスします。一晩で4°Cのコラーゲン溶液でポリアクリルアミドゲルをコード化します。翌日、PBSでゲルを3回洗います。
F-127溶液にオートクレーブPDMSステンシルを浸します。摂氏37度のインキュベーターに1時間保管してください。PDMSステンシルをPBSで3回洗浄し、PDMSステンシルとポリアクリルアミドゲルの両方から液体を取り除きます。
次に、ポリアクリルアミドゲルにPDMSステンシルを置き、そのステンシルにPBSを追加します。PDMSステンシルの穴の中の気泡を、穏やかにピペットして取り除きます。気泡を取り除いた後、PDMSステンシルの表面からPBSをクリアします。
次に、200マイクロリットルの細胞溶液をPDMSステンシルに加え、細胞がポリアクリルアミドゲルに付着するようにインキュベーターに1時間置きます。インキュベーションに続いて、細胞培養培地で細胞溶液を静かに洗い流し、さらに細胞培養培地を添加する。PDMSステンシルを取り外し、顕微鏡下で細胞島の形成を確認します。
次に、PDMSマイクロチャネルの表面を酸素プラズマで30秒間処理します。ポリアクリルアミドゲル充填底部ガラスの液体を取り除いた後、PDMSマイクロチャネルを底ガラスの上に置き、アセンブリをカスタムガラスホルダーに置きます。マイクロチャネルを細胞培養培地で満たします。
統合されたマイクロ流体システムの入口管を準備するために、トリムされた針および30センチメートルのミニボリュームラインを三方向のストップコックと接続する。これらの取り決めの3つを準備します。出口管の場合は、トリミングされた針と75センチメートルのミニボリュームラインを3ウェイストップコックで接続します。
チューブラインに、予熱された媒体を1時間充填します。注射器からプランジャーを取り除き、入口チューブラインを接続して、貯水池を準備します。各チューブラインの針コネクタを、マイクロ流体装置の3つの入口と1つの出口に差し込みます。
新鮮な培地または調整された培地の3ミリリットルで各貯水池を充填します。勾配試験のために、細胞培養培地中の1ミリリットル肝細胞増殖因子(HGF)で左入口貯留層を20ナノグラム充填する。濃度勾配の可視化のために、左入口貯留層に蛍光染料1ミリリットル当たり200マイクログラムを加える。
コンセントの管ラインをシリンジポンプに接続します。従来の蛍光顕微鏡のステージ上に、統合マイクロ流体システムを配置します。インキュベーターに収納された自動顕微鏡を使用して、最大24時間10分ごとに画像を撮影します。
各時点で、細胞移動を可視化する位相画像、ゲルに埋め込まれた蛍光ビーズを可視化する緑色蛍光画像、化学物質の濃度勾配を可視化する赤色蛍光画像など、3つの異なるチャネルで4X対物レンズを使用して一連の画像を撮影します。タイムラプス画像を撮影した後、0.25%トリプシン-EDTA溶液をマイクロチャネルに注入し、ポリアクリルアミドゲルから細胞を取り外します。ゲルから細胞を完全に除去した際に、蛍光性の緑色の画像を撮り、トラクション顕微鏡の基準画像として使用します。
テキストプロトコルの説明に従ってデータ分析に進みます。収縮力と細胞間ストレスを測定するために、トラクション顕微鏡と単層応力顕微鏡をマイクロ流体チャネルと組み合わせた。マップは、冷たい色を使用して暖かい色と内向きの牽引を使用して外向きの牽引と無線調整でプロットされました。
時間ゼロでは、すべての島は、島内のエッジと変動に強い内向きの牽引を持つ同様の牽引分布を示しました。HGF勾配を適用した10時間後、島の拡大の程度は各列で異なっていたが、トラクション分布はタイムゼロとほぼ同様であった。平均トラクションは10時間変わりませんでした。
しかし、単層応力を計算する際には、各列に異なる傾向が示されました。HGF濃度が低かった場合、島内の平均張力は10時間を通して約200パスカルを維持した。HGF濃度が高かったところでは、島内の平均張力は、前に示したように、10時間にわたって230パスカルから100パスカルに徐々に減少した。
HGF濃度が左半分で高く、島の右半分が低かったところで、平均張力は150パスカルの周りに維持された。マイクロ流体チャネルを充填することは穏やかでなければなりません。同時にマイクロ親細胞の島を破壊しない一方でチャネルに閉じ込められた気泡を除去することが重要です。
この統合システムを使用することで、ケモ誘引物質や成長因子などの様々な化学勾配に対して細胞集団がどのように機械的に反応するかを調べることができます。このプラットフォームは、再生、癌転移、および発達を理解するための鍵である化学勾配下の集団細胞移動の仕組みをさらに探求するのに役立ちます。
