Здесь мы представляем надежный протокол для обнаружения бактерий в биопсии ткани мочевого пузыря, который имеет широкое применение для многих типов тканей, где бактерии, как подозреваются, присутствуют. Основным преимуществом этой техники является то, что она непредвзята. Это позволяет исследователю обнаруживать бактерии в тканях без априори знания о том, какие бактериальные виды присутствуют.
Этот метод может помочь определить, если бактерии вторглись стенки мочевого пузыря женщин с рецидивирующей инфекции мочевыводящих путей и информировать терапевтический выбор, такие как выбор тканевых проникающих антибиотиков. Хотя предназначен для тканей мочевого пузыря, этот метод может быть широко применен к другим тканям с резидентов бактериальных популяций с минимальной оптимизацией. Лица, которые являются новыми для этой техники могут бороться с обложки размещения и изображения.
Сосредоточьтесь на оптимизации размещения крышки, чтобы уменьшить пузырьки и практики изображения на не-драгоценных образцов. Помочь продемонстрировать эту процедуру будет Яшкаран Гаджви, аспирант моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, очистить пустой капот дыма или надлежащим образом установлен биобезопасности шкаф с 70%этанола.
Подготовь все необходимые буферы и реагенты, изложенные в текстовом протоколе. Затем очистите пять банок Coplin с 70% этанола и дайте банкам высохнуть. Когда банки высохнут, обозначить их, как показано здесь, и заполнить их 100 миллилитров соответствующего решения.
В капоте дыма поместите два слайда на биопсию в вертикальную стойку слайда. Поместите вертикальную стойку слайда в банку Xylenes 1 Coplin в течение 10 минут. После этого, удалить слайд стойку из банки и пятно дно на бумажное полотенце, чтобы удалить избыток ксилеонов.
Поместите стойку в банку Xylenes 2 в течение 10 минут. А затем регидратировать де-парафинизированных секций тканей в последовательных этанола моет в течение 10 минут каждый. Когда моет полны, пятно нижней части слайд стойки на бумажные полотенца, чтобы удалить избыток этанола и поместить стойку в банку Coplin, содержащий 100 миллилитров фильтра стерилизованной, двойной дистиллированной воды в течение 10 минут.
Во время этой стирки разбавьте зонды до 10 наномолярных в буфере гибридизации, чтобы создать окрашивающий раствор, убедившись, что приготовьте 150 микролитров раствора окрашивания на слайд. Подготовьте увлажняющую камеру для каждого зонда, добавив пропитанную, скомканную деликатную протрите задачу и стерильную воду в резервуар коробки чаевых P1000. Поместите картридж держателя наконечника на вершине, как это, где слайды будут сидеть.
Когда окончательная стирка завершена, удалите слайд со слайда стойку и поместите их на свежее бумажное полотенце, ткани вверх. Используйте деликатную задачу протрите, чтобы высушить слайд, будучи осторожным, чтобы только осторожно мазок рядом, но не на разделе биопсии, чтобы фитиль от воды. Используя гидрофобную ручку, нарисуйте границу вокруг секции биопсии и поместите сторону слайд-ткани в увлажняющую камеру.
Затем поместите увлажняющую камеру в инкубатор, установленный до 50 градусов по Цельсию. Пипетт между 50 и 150 микролитров окрашивания раствора непосредственно на верхней части ткани, так что прямоугольник, сделанный гидрофобной границы вокруг ткани заполнены и закрыть коробку мягко. Инкубировать ночь при 50 градусах по Цельсию в темноте.
Если инкубатор имеет окно, накройте его остроумием алюминиевой фольги для создания темной среды. На следующее утро, удалить слайды из увлажняющих камер и быстро фитиль от любого оставшегося решения гибридизации с деликатной задачей протрите. Затем поместите стороны в вертикальную стойку окрашивания.
Поместите окрашивание стойки в алюминиевую фольгу завернутый Coplin банку, содержащую 100 миллилитров предварительно разогретого буфера мытья в течение 10 минут. Повторите этот шаг мытья еще два раза со свежим буфером мытья в новых банках Coplin. Во время этих шагов мытья, подготовить контр-пятно путем разбавления фондового раствора Hoechst 33342 в буфере мытья, в соотношении от одного до 1000.
В ту же трубку добавьте агглютинин зародыша пшеницы Alexa-555 к окончательной концентрации в пять микрограмм на миллилитр и фаллоидин Alexa-555 до конечной концентрации 33 наномолярных. Хранить в темноте до готовности к использованию. Когда окончательная стирка завершена, удалите слайды из банки Coplin и аккуратно фитиль от любого избыточного буфера мыть с деликатной задачей протрите.
Поместите слайды ткани стороне вверх на бумажное полотенце и добавить от 50 до 150 микролитров контр-пятно непосредственно на верхней части ткани, так что гидрофобные границы заполнены, но не переполнены. Обложка до четырех слайдов с криокабикатом и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого поместите слайды обратно в окрашивание стойки и мыть их в два раза больше в Coplin банки, содержащие свежий буфер мытья, с каждой стирки продолжительностью 10 минут.
Затем тщательно высушите горки и поместите их ткани стороне вверх на бумажное полотенце под криокамбокс-топ. Сожмите одну каплю монтажных средств массовой информации непосредственно на верхней части ткани и аккуратно поместите соответствующий размер крышки на вершине. Аккуратно нажмите любые пузыри и позволить слайды coverslip вылечить на ночь в темноте.
На следующий день, печать края coverslips на слайд с легким слоем ясно лака для ногтей и дайте высохнуть в темноте в течение 10 минут, прежде чем хранить их в темноте при четырех градусах по Цельсию. Когда вы будете готовы к изображению окрашенных биопсий, включите конфокальный микроскоп и программное обеспечение, связанное с микроскопом. Начните с положительного слайда FISH и переключитесь в режим визуализации компьютера.
Выберите каналы для 405, 488 и 555. Установите пинхол с помощью самого длинного волнового канала, который в данном случае составляет 555. Затем найдите текущую фокусную плоскость для визуализации помеченных бактерий в канале 488.
Без изменения фокусной плоскости установите усиление, лазерную мощность и компенсируйте для каждого канала так, чтобы сигнал не был насыщен и фон не был перекорректирован. Приобрети изображение во всех трех каналах. В этом исследовании, ткани связанных бактерий обнаруживаются в биопсии мочевого пузыря человека 16S rRNA FISH.
Этот протокол был оптимизирован для объективного обнаружения бактерий, связанных с слизистой оболочкой мочевого пузыря в парафин-встроенных участках биопсии мочевого пузыря. Здесь показаны репрезентативные конфокальные микрографы из эксперимента с использованием этого протокола на участках биопсии мочевого пузыря, полученных от женщин с рецидивирующими инфекциями мочевыводящих путей. Две серийные секции гибридизированы либо с универсальной 16S rRNA или карабкаться зондов.
Изображения ар взяты из той же области ткани и бактерий чисто видны в ткани гибридизированы с 16S rRNA зондов, но не с карабкаться зонд. Возможны также ложные положительные результаты. В этом репрезентативном ложноположительном сигнале, соответствующем аутофторесцентного коллагена или эластина обнаруживается в 405 и 488 каналах как в 16S rRNA, так и в гибридизированных секциях биопсии, подчеркивая важность постоянного использования контроля зонда схватки.
Чтобы предотвратить отбеливание фотографий, свести к минимуму воздействие ткани на свет после применения зондов. Хотя этот метод позволяет объективно обнаруживать бактерии в тканях человека, он не дает видам конкретной информации. Мультиплекс-FISH с таксономией конкретных зондов могут быть использованы для идентификации рода или вида настоящее время.
До того, как этот метод был разработан, ранее не было продемонстрировано, что бактерии могут вторгнуться в стенку мочевого пузыря человека рецидивирующих пациентов UTI. В настоящее время мы используем род и виды конкретных зондов, чтобы определить, какие бактериальные виды присутствуют. Xylenes должны быть использованы в дым капот из-за их токсичности.
Следует позаботиться о том, чтобы не заглянуть непосредственно в лазер во время визуализации. Лазер должен быть выключен при позиционировании слайда под целью.
