ここでは、細菌が存在すると疑われる多くの組織タイプに広範なアプリケーションを有する生検膀胱組織内の細菌の検出のための堅牢なプロトコルを提示する。この手法の主な利点は、公平な点です。これは、研究者がどの細菌種が存在するかを先取り知らずに組織内の細菌を検出することを可能にする。
この技術は、細菌が再発性尿路感染症を持つ女性の膀胱壁に侵入したかどうかを判断し、組織貫通性抗生物質の選択などの治療選択を知らせるのに役立つ可能性がある。膀胱組織のために設計されている間、この技術は、最小限の最適化で居住細菌集団を有する他の組織に広く適用することができる。この技術に新しい個人は、カバースリップの配置とイメージングに苦労する可能性があります。
気泡を減らすためにカバースリップの配置を最適化することに焦点を当て、貴重でないサンプルのイメージングを練習します。この手順を実証するのを手伝うのは、私の研究室の大学院生であるジャシュカラン・ガドヴィです。この手順を開始するには、空のヒュームフードを清掃するか、70%エタノールで適切に適合したバイオセーフティキャビネット。
テキストプロトコルに概説されているように、必要なバッファーおよび試薬をすべて準備します。次に、70%エタノールで5つのコプリン瓶をきれいにし、瓶を乾燥させます。瓶が乾燥したら、ここに示すようにラベルを付け、適切な溶液の100ミリリットルでそれらを埋めます。
ヒュームフードでは、生検ごとに2枚のスライドを垂直スライドラックに入れ。垂直スライドラックをキシレン1コプリン瓶に10分間置きます。この後、スライドラックを瓶から取り出し、ペーパータオルの底をしみ、余分なキシレンを取り除きます。
ラックをキシレン2ジャーに10分間入れます。次いで、各10分間連続したエタノールの水和を続けて、パラフィン解除した組織切片を再水和する。すすが完了したら、スライドラックの底をペーパータオルにかけ、余分なエタノールを取り除き、100ミリリットルのフィルターを含むコプリン瓶にラックを10分間2倍蒸留します。
この洗浄中に、プローブをハイブリダイゼーションバッファー内の10ナノモルに希釈して染色液を作成し、スライド当たり150マイクロリットルの染色液を調製してください。P1000チップボックスの貯水池に浸した、くしゃくしゃになった繊細な作業ワイプと無菌水を加えることによって、各プローブの加湿チャンバーを準備します。先端ホルダーカートリッジをスライドが置く場所の上に置きます。
最後の洗浄が完了したら、スライドラックからスライドを取り出し、新鮮なペーパータオル、ティッシュサイドの上に置きます。繊細な作業拭き取りを使用してスライドを乾燥させ、近くにやさしく手を出すだけで、生検セクションでは水を吸い取ないように注意してください。疎水性ペンを使用して、生検部の周りに境界線を描き、スライド組織側を加湿室に上に置きます。
次に、加湿室を摂氏50度に設定したインキュベーターに入れます。組織の周りの疎水性境界によって作られた長方形が充填され、箱を穏やかに閉じるように、組織の上に直接染色溶液の50〜150マイクロリットルの間のピペット。暗闇の中で摂氏50度で一晩インキュベート。
インキュベーターに窓がある場合は、アルミニウム箔を覆って暗い環境を作り出します。翌朝、加湿室からスライドを取り外し、繊細な作業ワイプで残りのハイブリダイゼーション溶液を素早く拭き取ります。その後、側面を垂直染色ラックに入れます。
100ミリリットルのプリウォーミングウォッシュバッファを含むアルミニウムホイル包み付きコプリン瓶に10分間、染色ラックを入れます。新しいコプリン瓶に新鮮な洗浄バッファーを使用して、この洗浄手順をさらに2回繰り返します。これらの洗浄工程の間、1~1000の比率で、Hoechst 33342のストック溶液を洗浄バッファーに希釈して対汚れを調製する。
同じチューブに、 Alexa-555小麦胚芽アグルチニンを 1 ミリリットル当たり 5 マイクログラムの最終濃度に加え、アレクサ-555 ファロイジンを最終的な濃度の 33 ナノモルに加えます。使用する準備ができるまで暗闇の中で保管してください。最後の洗浄が完了したら、コプリン瓶からスライドを取り出し、繊細なタスクワイプで余分な洗浄バッファーを静かに拭き取ります。
スライドのティッシュサイドをペーパータオルの上に置き、50~150マイクロリットルの対染色を組織の上に直接加え、疎水性の境界が埋まり、あふれないようにします。クライオボックストップで最大4枚のスライドを覆い、室温で10分間インキュベートします。この後、スライドを染色ラックに戻し、新鮮な洗浄バッファーを含むCoplin瓶でさらに2回洗浄し、各洗浄を10分間持続させます。
その後、スライドを徹底的に乾燥させ、クライオボックストップの下のペーパータオルの上にティッシュサイドを置きます。取り付け培地をティッシュの上に直接1滴絞り、適切なサイズのカバースリップを上にそっと置きます。泡をそっと押し出し、カバースリップスライドが暗闇の中で一晩治るようにします。
翌日、カバースリップの端を透明なマニキュアの軽いコートでスライドに密封し、暗闇の中で10分間乾燥させてから摂氏4度の暗闇の中に保管します。染色された生検を画像化する準備ができたら、共焦点顕微鏡と顕微鏡に関連するソフトウェアをオンにします。FISH ポジティブ スライドから始め、コンピューターの視覚化モードに切り替えます。
405、488、555のチャンネルを選択します。最も長い波長チャネル(この場合は555)を使用してピンホールを設定します。次に、488チャネルで標識細菌の可視化のための現在の焦点面を見つけます。
焦点面を変更せずに、信号が飽和せず、バックグラウンドが過剰に補正されないようなチャンネルごとにゲイン、レーザーパワー、オフセットを設定します。3つのチャンネルすべてで画像を取得します。本研究では、16S rRNA FISHによってヒト膀胱生検で組織関連細菌が検出される。
このプロトコルは、パラフィン埋め込まれた膀胱生検セクションにおける膀胱粘膜に関連する細菌の公平な検出のために最適化されています。ここに示されているのは、再発性尿路感染症の女性から得られた膀胱生検のセクションにこのプロトコルを使用した実験からの代表的な共焦点顕微鏡写真である。2つのシリアルセクションは、ユニバーサル16S rRNAまたはスクランブルプローブのいずれかでハイブリダイズされます。
組織と細菌の同じ領域から撮影された画像は、16S rRNAプローブとハイブリダイズした組織できれいに見えますが、スクランブルプローブとは一緒に見えません。偽陽性の結果も可能です。この代表的な偽陽性では、16S rRNAとスクランブルプローブの両方のバイオプシーセクションで405および488チャネルで自己蛍光コラーゲンまたはエラスチンに対応するシグナルが検出され、常にスクランブルプローブ制御を使用することの重要性を強調する。
光の漂白を防ぐために、プローブが適用された後に光への組織の暴露を最小限に抑えます。この技術は、ヒト組織における細菌の公平な検出を可能にするが、種固有の情報を与えるものではありません。分類学的プローブを有する多重魚は、存在する属または種を同定するために使用することができる。
この技術が開発される前に、細菌がヒト再発UTI患者の膀胱壁に侵入する可能性は以前には実証されていなかった。現在、属および種固有のプローブを使用して、どの細菌種が存在するかを判断しています。キシレンは、その毒性のためにヒュームフードに使用する必要があります。
イメージング中にレーザーを直接調べないように注意してください。目的の下にスライドを配置しながらレーザーをオフにする必要があります。
