Aqui apresentamos um protocolo robusto para a detecção de bactérias dentro do tecido da bexiga biópsia, que tem amplas aplicações para muitos tipos de tecidos onde suspeita-se que as bactérias estejam presentes. A principal vantagem desta técnica é que ela é imparcial. Permite que o pesquisador detecte bactérias dentro do tecido sem um conhecimento de que espécies bacterianas estão presentes.
Essa técnica pode ajudar a determinar se as bactérias invadiram as paredes da bexiga de mulheres com infecção do trato urinário recorrente e informar escolhas terapêuticas, como a seleção de antibióticos penetrantes no tecido. Embora projetada para tecidos da bexiga, essa técnica pode ser amplamente aplicada a outros tecidos com populações bacterianas residentes com otimização mínima. Indivíduos que são novos nessa técnica podem lutar com a colocação de deslizamentos e imagens.
Concentre-se na otimização da colocação de deslizamentos para reduzir bolhas e praticar imagens em amostras não preciosas. Ajudando a demonstrar este procedimento será Jashkaran Gadhvi, um estudante de pós-graduação no meu laboratório. Para iniciar este procedimento, limpe um capô de fumaça vazio ou um armário de biossegurança apropriadamente equipado com 70% de etanol.
Prepare todos os buffers e reagentes necessários conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, limpe cinco potes de Coplin com 70% de etanol e deixe os potes secarem. Quando os frascos estiverem secos, rotule-os como mostrado aqui e encha-os com 100 mililitros da solução apropriada.
No capô da fumaça, coloque dois slides por biópsia em um rack de slides vertical. Coloque o rack de deslizamento vertical no frasco de Xileno 1 Coplin por 10 minutos. Depois disso, remova o rack de slides do frasco e borre a parte inferior em uma toalha de papel para remover o excesso de xileno.
Coloque o rack no frasco de Xileno 2 por 10 minutos. E, em seguida, reidratar as seções de tecido desofinado em sucessivas lavagens de etanol por 10 minutos cada. Quando as lavagens estiverem completas, borre a parte inferior do rack de slides em toalhas de papel para remover o excesso de etanol e coloque o rack no frasco coplin contendo 100 mililitros de filtro esterilizado, água dupla destilada por 10 minutos.
Durante esta lavagem, diluir as sondas para 10 nanomolar em tampão de hibridização para criar a solução de coloração, certificando-se de preparar 150 microliters de solução de coloração por slide. Prepare uma câmara umidificante para cada sonda adicionando um lenço de tarefa delicado e água estéril embebedado e estéril a um reservatório de uma caixa de ponta P1000. Coloque o cartucho do suporte de ponta em cima, pois é aqui que os slides se sentarão.
Quando a lavagem final estiver completa, remova o slide do rack de slides e coloque-os em uma toalha de papel fresca, lado a tecido para cima. Use uma limpeza delicada para secar o escorregador, tomando cuidado para apenas gentilmente dab perto, mas não na seção de biópsia para afastar a água. Usando uma caneta hidrofóbica, desenhe uma borda ao redor da seção de biópsia e coloque o tecido deslizante de lado na câmara umidificante.
Em seguida, coloque a câmara umidificante em uma incubadora fixada a 50 graus Celsius. Pipeta entre 50 e 150 microliters da solução de coloração diretamente em cima do tecido para que o retângulo feito pela borda hidrofóbica ao redor do tecido seja preenchido e feche a caixa suavemente. Incubar durante a noite a 50 graus Celsius no escuro.
Se a incubadora tiver uma janela, cubra-a com a folha de alumínio para criar um ambiente escuro. Na manhã seguinte, remova os slides das câmaras umidificantes e afaste rapidamente qualquer solução de hibridização restante com uma delicada limpeza de tarefas. Em seguida, coloque os lados em um rack de coloração vertical.
Coloque o rack de coloração em um frasco coplin embrulhado em papel alumínio contendo 100 mililitros do tampão de lavagem pré-aquecido por 10 minutos. Repita esta etapa de lavagem mais duas vezes com tampão de lavagem fresco em novos frascos de Coplin. Durante estas etapas de lavagem, prepare a contra-mancha diluindo uma solução de estoque de Hoechst 33342 no buffer de lavagem, a uma proporção de um a 1000.
No mesmo tubo, adicione aglutinina de germe de trigo Alexa-555 a uma concentração final de cinco microgramas por mililitro e alexa-555 phalloidina a uma concentração final de 33 nanomolar. Armazene no escuro até estar pronto para usar. Quando a lavagem final estiver completa, remova os slides do frasco coplin e afaste delicadamente qualquer tampão de lavagem em excesso com uma delicada limpeza de tarefa.
Coloque os slides de lado tecidual sobre uma toalha de papel e adicione entre 50 e 150 microliters de contra-mancha diretamente em cima do tecido para que a borda hidrofóbica seja preenchida, mas não transbordando. Cubra até quatro slides com uma criobox-top e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Depois disso, coloque os slides de volta no rack de coloração e lave-os mais duas vezes em frascos de Coplin contendo tampão de lavagem fresco, com cada lavagem com duração de 10 minutos.
Em seguida, seque completamente as lâminas e coloque-as de lado em uma toalha de papel sob uma criobox-top. Esprema uma gota de mídia de montagem diretamente em cima do tecido e coloque suavemente uma mancha de cobertura de tamanho apropriado em cima. Pressione suavemente todas as bolhas e permita que os slides de deslizamento de cobertura curem durante a noite no escuro.
No dia seguinte, sele as bordas das tampas para o slide com uma camada clara de esmalte claro e deixe secar no escuro por 10 minutos, antes de armazená-las no escuro a quatro graus Celsius. Quando estiver pronto para a imagem das biópsias manchadas, ligue o microscópio confocal e o software associado ao microscópio. Comece com um slide positivo fish e mude para o modo de visualização do computador.
Selecione os canais para 405, 488 e 555. Defina o orifício usando o canal de comprimento de onda mais longo, que neste caso é 555. Em seguida, encontre o plano focal atual para visualização de bactérias rotuladas no canal 488.
Sem alterar o plano focal, defina o ganho, a potência do laser e o deslocamento para cada canal de tal forma que o sinal não esteja saturado e o fundo não seja super corrigido. Adquira a imagem nos três canais. Neste estudo, bactérias associadas ao tecido são detectadas em biópsias da bexiga humana por 16S rRNA FISH.
Este protocolo foi otimizado para a detecção imparcial de bactérias associadas à mucosa da bexiga em seções de biópsia da bexiga incorporada à parafina. Aqui são mostrados micrografos confocal representativos de um experimento usando este protocolo em seções de biópsias da bexiga obtidas de mulheres com infecções recorrentes do trato urinário. Duas seções seriais são hibridizadas com as sondas universais de rRNA 16S ou scramble.
As imagens tiradas da mesma região do tecido e bactérias são limpamente visíveis no tecido hibridizado com as sondas de rRNA 16S, mas não estão com a sonda de scramble. Resultados falsos positivos também são possíveis. Neste falso positivo representativo, um sinal correspondente ao colágeno ou decorrido autofluorescente é detectado nos canais 405 e 488 nas seções de biópsia hibridizada de rRNA e sonda scramble, destacando a importância de sempre utilizar um controle de sonda de scramble.
Para evitar o branqueamento fotográfico, minimize a exposição do tecido à luz após a aplicação das sondas. Embora essa técnica permita a detecção imparcial de bactérias em tecidos humanos, ela não fornece informações específicas às espécies. Multiplex-FISH com sondas específicas de taxonomia poderia ser usado para identificar o gênero ou espécies presentes.
Antes desse desenvolvimento desta técnica, não havia sido demonstrado anteriormente que as bactérias poderiam invadir a parede da bexiga de pacientes humanos recorrentes da UTI. Agora estamos usando sondas específicas de gênero e espécies para determinar quais espécies bacterianas estão presentes. Xileno deve ser usado em um capuz de fumaça devido à sua toxicidade.
Deve-se tomar cuidado para não olhar diretamente para o laser durante a imagem. O laser deve ser desligado enquanto posiciona seu slide sob o objetivo.
