使用Cytofast和上游聚类方法流和细胞溅的高维细胞测量数据的可视化和量化

质量细胞学生成的数据很复杂，需要以高效、简单的方式进行可视化。细胞法斯特是一种强调免疫细胞群中免疫模式并确定与临床治疗或实验组相关的细胞子集的方法。细胞法斯特可以应用后，任何结晶方法，如流SOM或细胞孢子。

它将允许你发现一个细胞子集，这是链接到临床治疗或实验组。使用此方法，您将能够以定量方式一目了然地查看数据的免疫学概览。首先使用 Cytosplore 或 FlowSOM 创建群集。

如果使用 Cytosplore，则通过单击"文件"并打开 FCS 文件上传 FCS 文件。然后在提示时选择双曲 ArcSinh 转换的辅助因子，然后单击添加唯一的样本标记作为通道。选择运行 HSNE 以运行 HSNE 级别为 3，并等待生成映射。

在第一个 HSNE 级别，通过选择 CD161 阳性单元格和右键单击放大选择，检查 CD161 阳性的单元格。在第二级，重复该过程以仅使用 CD161 阳性事件到达第三级。生成最后一个 TSNE 映射后，通过右键单击地图并选择保存群集来保存 Cytosplore 定义的群集。

选择由 Cytosplore 提示的输出文件的目录并注意此位置，因为它稍后将用于将 FSC 文件加载到 R.在重命名输出文件时仅使用简单字符名称，这样识别和进一步处理将更容易并选择保存。使用指定的函数 readcytosploreFCS 将文件加载到 R 中。要清除数据，请通过检查列与不必要的参数相关的位置并将其从矩阵中删除来删除一些参数，如时间和背景。

接下来，重新排序标记，以便先显示血统标记，后跟功能标记。通过上传包含临床信息的电子表格元文件，将元数据文件链接到 Cytosplore 生成的数据。若要按 FlowSOM 执行群集，请使用读取加载以前在 R 中的 CD161 阳性事件上封闭的原始数据。

流集函数。通过选择正确的列以 ArcSinh5 方式转换数据来选择相关的生物标记。通过选择函数中的共facter=5 来应用五的辅助因子。

使用 FlowSOM 函数对数据进行群集，然后通过选择将数据聚类到 10 个子集中，与 Cytosplore 以前产生的输出进行比较。然后将每个单元格分配给其标识的子集和示例 ID. 加载包含组分配的 R 中的元数据文件，并使用文本手稿中的代码将其链接到 FCS 文件。根据从 FlowSOM 获得的数据帧创建 CF 列表。

然后重新排列标记，使其显示为类似于 Cytosplore 分析的输出。在创建热图之前，使用函数单元格计数生成每个样本的计数表。由于某些群集包含的单元格少于其他群集，因此通过在函数内指定 scale=true 来缩放每个群集的数据，从而便于查看样本之间的分散。

使用热图可视化数据，然后通过生成单元计数而不是缩放数据来获取每个群集的频率，从而使用框图进行可视化。最后，通过注意到标记名称可视化 CD45、CD11c 和 CD54 标记的表达强度，并在 MSI 绘图函数中包含它们。Cytofast 运行几个可能的输出，包括分析中标识并基于标记表达式的所有聚类的热图。

顶部的树突图表示标识的群集之间的分层相似性。上面板显示另一个热图，显示每个样本中相应子集的相对数量。同时，右侧的树突图显示样本之间的相似性，根据子集频率显示，自然杀伤细胞的表型在注射三天后通过PD-L1处理形成。

组合热图可以获取 FlowSOM，其次是细胞法斯特和细胞孢子，然后是细胞法斯特。Cytofast 还可用于定量显示数据，并在框图中显示结果。Cytofast 封装中包含的另一个功能是 MSI 绘图函数，该函数显示每个组每个标记的中位数信号强度图。

此功能允许检测全局变化，例如PD-L1治疗组自然杀伤细胞中CD54或CD11c的表达增加。这种技术是一种快速可视化和量化数据的方法，可用于发现治疗后新的细胞反应。此方法之后，R 中的全局测试包可用于测试一组协变量，以表示与响应变量的关联。

这将显示每个子集与临床结果之间的相关性。