Cytofast 및 업스트림 클러스터링 방법 FlowSOM 및 Cytosplore를 사용하여 고차원 세포 측정 데이터의 시각화 및 정량화

질량 세포측정에 의해 생성된 데이터는 복잡하고 효율적인 방식으로 간단한 방식으로 시각화되어야 합니다. Cytofast는 면역 세포 인구 내의 면역 학적 패턴을 강조하고 임상 치료 또는 실험 그룹에 연결되는 세포 하위 집합을 결정하는 방법입니다. Cytofast는 FlowSOM 또는 Cytosplore와 같은 결정적 방법 후에 적용될 수 있습니다.

그것은 임상 치료 또는 실험 그룹에 연결 되는 세포 하위 집합을 발견 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 데이터의 면역 개요를 정량적으로 한눈에 볼 수 있습니다. 먼저 사이토스플로레 또는 FlowSOM이 있는 클러스터를 만듭니다.

Cytosplore를 사용하는 경우 파일을 클릭하고 FCS 파일을 열어 FCS 파일을 업로드합니다. 그런 다음 프롬프트할 때 Hyperbolic ArcSinh 변환에 대한 보조 요소를 선택하고 고유한 샘플 태그를 채널로 추가하려면 클릭합니다. HSNE 실행을 선택하여 HSNE 레벨을 3으로 실행하고 맵이 생성될 때까지 기다립니다.

첫 번째 HSNE 수준에서 CD161 양수 셀을 선택하고 선택으로 마우스 오른쪽 확대/축소를 선택하여 CD161에 대해 양수셀을 확인합니다. 두 번째 수준에서 는 CD161 양수 이벤트만으로 세 번째 레벨에 도달하기 위해 절차를 반복합니다. 마지막 TSNE 맵이 생성되면 지도를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 저장 클러스터를 선택하여 Cytosplore에 의해 정의된 클러스터를 저장합니다.

Cytosplore에 의해 묻는 대로 출력 파일의 디렉토리를 선택하고 나중에 R.Use에 FSC 파일을 로드하는 데 사용되므로 식별 및 추가 처리가 더 쉬워지고 저장을 선택할 수 있습니다. 지정된 함수 readcytosploreFCS로 파일을 R에 로드합니다. 데이터를 정리하려면 불필요한 매개 변수와 관련된 열의 위치를 확인하고 행렬에서 제거하여 시간 및 배경과 같은 일부 매개 변수를 제거합니다.

그런 다음 계보 마커가 먼저 표시되도록 마커를 다시 정렬한 다음 기능성 마커가 표시됩니다. 임상 정보가 포함된 스프레드시트 메타파일을 업로드하여 데이터 데이터를 Cytosplore에서 생성된 데이터에 연결합니다. FlowSOM에서 클러스터링을 수행하려면 이전에 CD161 양수 이벤트에 대해 읽은 원시 데이터를 R의 로딩합니다.

플로우셋 기능. 적절한 컬럼을 선택하고 ArcSinh5 방식으로 데이터를 변환하여 관련 생물학적 마커를 선택합니다. 함수에서 동면 =5를 선택하여 5인조의 공동 계수를 적용합니다.

FlowSOM 함수를 사용하여 데이터를 클러스터화하고 이전에 Cytosplore에서 산출한 출력과 동일한 10개의 하위 집합에서 데이터를 클러스터로 선택하여 FlwoSOM 및 Cytosplore를 비교합니다. 그런 다음 각 셀을 식별된 하위 집합에 할당하고 ID.그룹 할당을 포함하는 R의 메타데이터 파일을 로드하고 텍스트 원고의 코드를 사용하여 FCS 파일에 연결합니다. FlowSOM에서 얻은 데이터 프레임을 기반으로 CF 목록을 만듭니다.

그런 다음 마커를 순서대로 시토스플로레 분석의 출력과 유사하게 표시합니다. 히트 맵을 만들기 전에 함수 cellCount를 사용하여 샘플당 카운트 테이블을 생성합니다. 일부 클러스터에는 다른 클러스터보다 셀수가 적기 때문에 함수 내부에 scale=true를 지정하여 클러스터당 데이터를 배율조정하여 샘플 간의 분산을 쉽게 볼 수 있습니다.

열 맵으로 데이터를 시각화한 다음 셀 수를 생성하지만 각 클러스터의 빈도를 얻기 위해 데이터를 배율 조정하지 않음으로써 상자 플롯으로 시각화합니다. 마지막으로, 주목 마커 이름으로 CD45, CD11c 및 CD54 마커의 발광 강도를 시각화하고 MSI 플롯 함수에 포함한다. Cytofast는 분석에서 식별되고 마커 식을 기반으로 하는 모든 클러스터의 열 지도를 포함하여 몇 가지 가능한 출력을 실행합니다.

맨 위에 있는 dendrogram은 식별된 클러스터 간의 계층적 유사성을 나타냅니다. 위쪽 패널에는 각 샘플에서 해당 하위 집합의 상대적 수량을 보여주는 다른 열 맵이 표시됩니다. 한편, 오른쪽의 덴드로그램은 주입 후 3일 후에 PD-L1 치료에 의해 천연 킬러 세포의 표현형이 형성된다는 것을 보여주는 하위 세트 주파수에 기초한 샘플 간의 유사성을 나타낸다.

결합 된 열지도는 FlowSOM 다음에 사이토 패스트와 사이토스 플로어 다음에 사이토 패스트를 얻을 수 있습니다. Cytofast는 데이터를 정량적으로 제시하고 결과를 상자 플롯에 표시하는 데 사용할 수도 있습니다. Cytofast 패키지에 포함된 또 다른 기능은 그룹당 모든 마커의 중앙신호 강도 플롯을 표시하는 MSI 플롯 함수입니다.

이 기능을 사용하면 PD-L1 처리 군의 천연 킬러 세포에서 CD54 또는 CD11c의 발현 증가와 같은 글로벌 변화를 검출할 수 있습니다. 이 기술은 데이터를 시각화하고 정량화하는 빠른 방법이며 치료 후 새로운 세포 반응을 발견하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법 이후에 R의 전역 테스트 패키지를 사용하여 응답 변수와의 연결을 위해 공변체 그룹을 테스트할 수 있습니다.

이것은 각 서브세트와 임상 결과 사이 상관관계를 보여줄 것입니다.