Os dados gerados pela citometria em massa são complexos e precisam ser visualizados de forma eficiente e simples. Citofast é um método que destaca padrões imunológicos dentro da população de células imunes e determina subconjuntos celulares que estão ligados a tratamentos clínicos ou grupos experimentais. O citofasto pode ser aplicado após qualquer método de cristal agem como FlowSOM ou Cytosplore.
Ele permitirá que você descubra um subconjunto celular que está ligado ao tratamento clínico ou a um grupo experimental. Com este método, você poderá ver a visão geral imunológica dos dados de uma forma quantitativa. Comece criando clusters com Cytosplore ou FlowSOM.
Se estiver usando Cytosplore, carregue os arquivos FCS clicando em Arquivos e abra arquivos FCS. Em seguida, selecione um cofator para transformação de ArcSinh hiperbólico quando solicitado e clique em adicionar tag de exemplo exclusiva como canal. Selecione executar HSNE para executar um nível HSNE de três e esperar que o mapa seja gerado.
No primeiro nível de HSNE, verifique as células positivas para CD161 selecionando as células positivas cd161 e clicando com o botão direito do zoom na seleção. No segundo nível, repita o procedimento para chegar ao terceiro nível com apenas eventos positivos de CD161. Uma vez que o último mapa TSNE seja gerado, salve os clusters definidos pelo Cytosplore clicando com o botão direito do mouse no mapa e escolhendo salvar clusters.
Escolha o diretório dos arquivos de saída conforme solicitado pelo Cytosplore e observe este local, pois ele será usado mais tarde para carregar arquivos FSC em R.Use um nome de caracteres simples apenas ao renomear os arquivos de saída que facilitarão a identificação e o manuseio mais fácil e selecionarão salvar. Carregue os arquivos em R com a função designada readcytosploreFCS. Para limpar os dados, remova alguns parâmetros, como tempo e antecedentes, verificando a posição da coluna relacionada aos seus parâmetros desnecessários e removendo-os da matriz.
Em seguida, reordene os marcadores para que os marcadores de linhagem sejam exibidos primeiro seguidos por marcadores funcionais. Vincule o arquivo de metadados aos dados gerados do Cytosplore carregando o metafile da planilha contendo informações clínicas. Para realizar o clustering pelo FlowSOM, carregue os dados brutos que foram previamente fechados em eventos positivos cd161 em R com a leitura.
Função flowSet. Selecione os marcadores biológicos relevantes selecionando as colunas adequadas e transformando os dados de forma ArcSinh5. Aplique um cofator de cinco escolhendo cofacter=5 na função.
Cluster os dados usando a função FlowSOM e compare FlwoSOM e Cytosplore escolhendo agrupar os dados em 10 subconjuntos iguais aos anteriormente produzidos pela Cytosplore. Em seguida, atribua cada célula ao seu subconjunto identificado e iD de amostra.Carregue o arquivo metadados em R contendo a atribuição do grupo e vincule-o aos arquivos FCS usando o código do manuscrito de texto. Crie uma lista CF com base no dataframe obtido do FlowSOM.
Em seguida, reordene os marcadores para aparecerem de forma semelhante à saída da análise cytosplore. Antes de criar os mapas de calor, gere a tabela de contagem por amostra usando o cellCount de função. Uma vez que alguns clusters contêm menos células do que outros, dimensione os dados por cluster especificando escala=true dentro da função que facilita a visualização entre as amostras.
Visualize os dados com um mapa de calor e visualize com plots de caixa gerando a contagem de células, mas não dimensionando os dados para obter a frequência de cada cluster. Por fim, visualize a intensidade de expressão dos marcadores CD45, CD11c e CD54 pelos nomes dos marcadores de observação e incluindo-os na função de plot MSI. O Citofast executa várias saídas possíveis, incluindo o mapa de calor de todos os clusters identificados na análise e com base na expressão do marcador.
O dendrograma na parte superior representa a semelhança hierárquica entre os aglomerados identificados. O painel superior exibe outro mapa de calor mostrando a quantidade relativa de subconjuntos correspondentes em cada amostra. Enquanto isso, o dendrograma à direita mostra a semelhança entre amostras baseadas em frequências subconjuntas demonstrando que o fenótipo de células assassinas naturais é moldado pelo tratamento PD-L1 três dias após a injeção.
Os mapas de calor combinados podem ser obtidos para o FlowSOM seguido por Cytofast e para Cytosplore seguido por Cytofast. O citofast também pode ser usado para apresentar os dados quantitativamente e exibir os resultados em parcelas de caixa. Outra característica que está incluída no pacote Cytofast é a função de enredo MSI que mostra o gráfico de intensidade de sinal mediano de cada marcador por grupo.
Esta função permite a detecção de mudanças globais, como aumentos na expressão de CD54 ou CD11c em células assassinas naturais do grupo tratado PD-L1. Esta técnica é uma maneira rápida de visualizar e quantificar dados e pode ser usada para descobrir novas respostas celulares após a terapia. Após este método, o pacote de teste global em R pode ser usado para testar um grupo de covariáveis para associação com variáveis de resposta.
Isso mostrará a correlação entre cada subconjunto e o desfecho clínico.
