質量サイトメトリーによって生成されるデータは複雑であり、効率的かつ簡単な方法で視覚化する必要があります。Cytofastは、免疫細胞集団内の免疫学的パターンを強調し、臨床処置または実験群に関連する細胞サブセットを決定する方法である。フローソムやサイトスプロアのような任意の結晶化法の後に細胞性を適用することができます。
臨床治療や実験グループにリンクされている細胞サブセットを発見することができます。この方法を使用すると、データの免疫学的概要を定量的に一目で確認できるようになります。まず、サイトスプロアまたはフロー SOM を使用してクラスターを作成します。
Cytosplore を使用している場合は、[ファイル] をクリックして FCS ファイルをアップロードし、FCS ファイルを開きます。次に、プロンプトが表示されたら、ハイパーボリック ArcSinh 変換の補因子を選択し、[チャネルとして一意のサンプル タグを追加] をクリックします。「HSNE を実行」を選択して HSNE レベル 3 を実行し、マップが生成されるのを待ちます。
最初の HSNE レベルで、CD161 の正のセルを選択し、右クリックして選択にズームして、CD161 に正のセルを確認します。2 番目のレベルでは、CD161 陽性イベントのみで 3 番目のレベルに到達する手順を繰り返します。最後の TSNE マップが生成されたら、マップを右クリックして保存クラスターを選択して、Cytosplore によって定義されたクラスターを保存します。
Cytosplore によってプロンプトされた出力ファイルのディレクトリを選択し、後で FSC ファイルを R.にロードするために使用されるため、この場所に注意してください。指定された関数 readcytosploreFCS を使用して、ファイルを R に読み込みます。データを消去するには、不要なパラメータに関連する列の位置をチェックし、マトリックスから削除することで、時間や背景などの一部のパラメータを削除します。
次に、マーカーの順序を変更して、最初にリネージュ マーカーを表示し、次に機能マーカーを表示します。臨床情報を含むスプレッドシートメタファイルをアップロードして、メタデータファイルをCytosploreから生成されたデータにリンクします。FlowSOM によるクラスタリングを実行するには、以前に読み取りで R の CD161 陽性イベントにゲートされた生データをロードします。
関数を設定します。適切な列を選択し、ArcSinh5 方式でデータを変換することにより、関連する生物学的マーカーを選択します。関数でコファクト=5を選択して、5 の補因子を適用します。
FlowSOM 関数を使用してデータをクラスター化し、Cytosplore によって以前に生成された出力と同じ 10 個のサブセットのデータをクラスター化することを選択して、FlwoSOM と Cytosplore を比較します。次に、識別されたサブセットとサンプル ID に各セルを割り当てます。FlowSOM から取得したデータフレームに基づいて CF リストを作成します。
次に、マーカーを、サイトスプロア解析の出力と同様に表示されるように並べ替えます。ヒート マップを作成する前に、関数 cellCount を使用してサンプルごとのカウント テーブルを生成します。一部のクラスターは他のクラスターよりもセル数が少ないので、サンプル間の分散を見やすくする関数内で scale=true を指定して、クラスターごとにデータをスケーリングします。
ヒート マップを使用してデータを視覚化し、セル数を生成してボックス プロットを視覚化しますが、データをスケーリングして各クラスターの頻度を取得します。最後に、CD45、CD11cおよびCD54マーカーの発現強度を、そのマーカー名を示して、MSIプロット関数に含めて可視化する。Cytofast は、解析で識別され、マーカーの式に基づいて、すべてのクラスターのヒート マップを含むいくつかの可能な出力を実行します。
上部の樹状図は、識別されたクラスター間の階層的な類似性を表します。上部パネルには、各サンプルの対応するサブセットの相対量を示す別のヒートマップが表示されます。一方、右側の樹状図は、天然キラー細胞の表現型が注射の3日後にPD-L1処理によって形成されることを示すサブセット周波数に基づくサンプル間の類似性を示している。
結合されたヒートマップは、FlowSOMの後にサイトファストとサイトスプラレの後に続いて細胞断食のために得ることができる。Cytofast は、データを定量的に表示し、結果をボックス プロットで表示するためにも使用できます。Cytofast パッケージに含まれるもう 1 つの機能は、グループごとに各マーカーの中央値信号強度プロットを示す MSI プロット関数です。
この機能は、PD-L1処理群のナチュラルキラー細胞におけるCD54またはCD11cの発現の増加などのグローバル変化を検出することを可能にする。この技術は、データを視覚化して定量化する迅速な方法であり、治療後の新しい細胞応答を発見するために使用することができます。このメソッドの後、R のグローバル テスト パッケージを使用して、応答変数との関連付けについて共変量のグループをテストできます。
これは、各サブセットと臨床結果の間の相関関係を示します。
