明胶美沙克里洛醇水凝胶生物油墨3D生物印刷方案

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December 21st, 2019

DOI :

10.3791/60545-v

December 21st, 2019

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Mingjun Xie¹^,², Kang Yu¹^,², Yuan Sun¹^,², Lei Shao¹^,², Jing Nie¹^,², Qing Gao¹^,², Jingjiang Qiu³, Jianzhong Fu¹^,², Zichen Chen¹^,², Yong He¹^,²

¹State Key Laboratory of Fluid Power and Mechatronic Systems, School of Mechanical Engineering, Zhejiang University, ²Key Laboratory of 3D Printing Process and Equipment of Zhejiang Province, School of Mechanical Engineering, Zhejiang University, ³School of Mechanics and Safety Engineering, Zhengzhou University

副本

基于凝胶水凝胶的仿生学在3D生物印刷中非常流行。然而，低粘度限制了其可打印性。在这里，我们与其他研究人员分享在实验室中打印 GelMA 的策略。

在这段视频中，我们充分利用了这种生物材料的特殊特性，并提出了几种用于不同3D结构的打印方法，这些方法有助于进一步的生物医药应用。以器官损伤为例，通过注射嵌入或追踪印刷的GelMA结构，有可能用于相应的治疗。在短时间内完全溶解冻干的凝胶是不容易的。

为了加快溶解过程，可以使用涡流混合器。每个生物材料将使用凝胶MA的特殊属性。我建议一个新的化学器应该正确地采取什么是条件关键在打印时徘徊。

操作详细信息确定打印过程是否成功。这就是为什么我们选择一个视觉演示与其他研究人员分享。制造微球首先将两个金属环电极与接地极和正极连接。

将金属板与环电极下方的高压连接，将带硅油的培养盘作为液滴接收器放在金属板上。通过溶解冷冻干燥的GelMA和 LAP和DPBS过滤它通过0.22微米过滤器进行无菌，然后在37摄氏度的水浴中加热15分钟，准备生物墨水。分离MDA-MB-231细胞与三毫升0.25%的三普辛和0.02%的EDTA溶液在37摄氏度下三分钟。

将细胞转移到15毫升管中，并在100次G下离心5分钟。去除上流水，通过缓慢上下移液，将细胞与一毫升准备好的生物墨水混合，确保避免气泡。将一毫升的生物墨水和细胞混合物吸进三毫升无菌注射器中。

用压缩空气的力量喂给生物墨水，然后将注射器放在夹具上。打开高压电源，将电压设置为零至四千伏。同时打开 405 纳米波长的光，将 GelMA 液滴在五毫升硅油中交叉连接。

去掉培养皿以去除大部分硅油，用勺子将剩余的油和微球转移到15毫升的离心管中。加入五毫升的 DPBS，以 100 倍 G 摇动混合物离心管，然后取出上盖。将微球转移到带DMEM的培养皿中，并在37摄氏度和5%的二氧化碳下培养它们，为期三天。

三天后丢弃介质，用 DPBS 清洗微球。在室温下用两毫升 4% PFA 的毫升将其修复 30 分钟，然后丢弃 PFA 并重复洗涤。在室温下用两毫升0.5%的非离子表面活性剂对细胞进行渗透，5分钟，丢弃表面活性剂，用DPBS清洗微球。

接下来用TRITC-phalloidin将细胞染色30分钟，然后DAPI在黑暗中染色10分钟，每次染色后丢弃染料，用DPBS清洗球体。使用共和荧光显微镜成像微球。以2%的重量和体积比在脱离子水中溶解灭菌的藻酸钠粉末。

准备无菌生物墨水溶液，如前所述，然后在37摄氏度的水浴中加热生物墨水和藻酸钠15分钟。根据前面描述的MDA-MB 231细胞程序，对bMSC进行试穿和离心，然后去除上流液，然后用2毫升的GelMA生物墨水重新泵化细胞颗粒。将两毫升的生物墨水细胞混合物吸进10毫升注射器和两毫升藻酸钠混合物中，放入另一个注射器中。

以每分钟 50 微米的生物墨水和每分钟 350 微米的生物墨水为解决方案提供解决方案。打开 405 纳米波长的光，照射透明管，并交叉连接 GelMA 光纤。使用培养皿接收纤维，然后用勺子收集。

将纤维转移到带DMEM/F12的培养皿中，并在37摄氏度和5%的二氧化碳下培养三天。培养后，细胞遵循前面描述的在共和荧光显微镜下观察纤维的方向。溶解冷冻干燥的凝胶和 LAP 和 DPBS，并在溶液中加入洋红色食用颜料，以提高打印精度。

通过0.22微米过滤器过滤溶液，使无菌，并在37摄氏度的水浴中加热15分钟。使用 CAD 软件构建 3D 模型，将模型文档导入应用 DLP 生物打印机的上部软件。在生物打印机的槽中加入十毫升的准备好的生物墨水。

根据手稿方向设置打印参数，然后开始打印。完成后，从生物打印机上取下打印结构，并将其浸入培养皿中的 DPBS 中。分离和颗粒MDA-MB 231细胞，如前所述。

用两毫升 DMEM 重新悬浮，并将悬浮液添加到打印结构中。培养37摄氏度的细胞和5%的二氧化碳三天，然后准备结构观察与共理荧光显微镜，如前面所述。准备 10% 的重量到体积 GelMA 和 0.5% 的重量到体积 LAP 解决方案，然后通过 0.22 微米过滤器进行过滤。

在紫外光下消毒明胶粉 30 分钟，以 5% 的重量与体积比将其添加到 GelMA LAP 溶液中。在37摄氏度的水浴中加热混合物15分钟。用准备好的生物墨水填充模具，并把它们放在4摄氏度的冰箱中30分钟。

使用刀片从模具中去除部分交对水凝胶片。将 2D 模制水凝胶片混合，在 405 纳米照射下照射一分钟，将其与 GelMA 粘合。分离和颗粒 HUVEC 将细胞与两毫升 DMEM 混合，然后用喷嘴和注射器将悬浮液注入微通道。

接下来的三个小时，每 15 分钟翻转一次芯片，以实现均匀和完整的电池座椅。在37摄氏度和5%的二氧化碳下培养皿中的碎屑，然后准备进行形态学观察。当GelMA液滴落入接收硅油中时，它们保持了标准的球形形状，没有尾巴。

经历高压电场力的封装电池保持了其扩散能力，验证了电辅助制造方法的生物相容性。选择DLP生物打印机制造具有更复杂的形状的GelMA结构，如鼻耳和多腔室。种子HUVEC附着在GelMA材料上，并扩散在交链接的GelMA结构的表面，表明此应用具有组织工程的潜力。

两次交叉链接策略用于制造基于凝胶MA的微流体芯片。各种微通道的芯片是按需设计不同模具的，HUVEC在通道中播种，并连接到通道壁上，形成宏体形状。制造微球时应用高压源。

研究人员必须检查电路之前，不要触摸暴露的毫巴保护运营商或使细胞免受短路损坏。超声波水基可能是另一种选择，以加快值得的速度。这一贡献肯定总结了我们实验室中GelMA的3D生物打印方法。

研究人员可以参考视频，改进或扩展打印策略，以满足进一步的生物医学需求。

摘要

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154 3D GelMA DLP

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