该协议为海洋无脊椎动物提供了一种易于处理和广泛兼容的初级细胞培养方法。这项技术为研究人员提供了一种在相对较短的时间内培养海洋无脊椎细胞的方法。细胞培养应具有一致的遗传背景，用于海洋生物学研究中不同的生物实验应用。
对于这一领域的新研究，我们认为，指示的简化协议应该是锻炼的好选择。麻醉后，解剖和收集前肠，然后垂直分部组织样本，去除内层。在PBS中清洗组织样本两次，并在75%乙醇溶液中浸入消毒，持续不超过两秒钟。
然后将PBS中的组织样品洗涤三次，取出乙醇，将约100毫克的组织样品转移到两毫升无菌微离心管中。将1.5毫升预优化培养基加入海参肠道组织块，用灭菌手术剪刀切碎块，直到溶液浑浊。添加 400 微升 0.25% 的 trypsin。
通过反转混合溶液，并在室温下孵育五分钟。然后使用100微米细胞滤株过滤溶液，并在新的无菌两毫升微型离心管中收集滤液。对于可选的简化协议，培养培养基中切割的组织块可以直接转移到培养皿中，然后孵育。
在1700xG下离心管3分钟，丢弃上先液，然后用抗生素重新悬浮培养介质中的颗粒，然后用培养介质洗涤两次。为细胞培养预先设置培养箱，并在18摄氏度的温度和饱和的湿度下至少提前运行24小时。然后使用指示介质的200微升重新悬浮细胞，并将它们转移到四厘米的盘子中。
培养孵化器中的细胞。六小时后，将它们从培养箱中取出，并在细胞培养皿中加入两毫升指示的培养剂。每12小时，更换一半的介质。
五到七天后，细胞开始分裂。通过将指示的抗生素、青霉素、链霉素和根霉素在培养基中的浓度减少一半，减少抗生素的不利影响。每两到三天更换细胞培养培养。
当原细胞密度达到60%传导细胞传通时。首先，在室温下使用PBS清洗培养细胞两次。在每个菜中加入200微升0.25%的三辛溶液，并手动搅拌菜肴，确保覆盖整个底部。
丢弃三辛溶液，在室温下孵育细胞五分钟。通过移液和重新悬浮细胞，用一毫升新鲜培养剂清洗细胞。将0.5毫升的细胞悬浮液转移到新盘中。
加入1.5毫升的新鲜介质，在18摄氏度下孵育细胞。12小时后，改变介质，在显微镜下观察细胞，以评估条件。准备三个实验组，包括一个控制组和两组溶液，其中一个微摩尔和100微摩尔德西梅萨酮。
在0小时、24小时或48小时内有或没有二氧基酮的孵育后，用PBS清洗细胞三次。关灯后，将每孔300微升的铲33258溶液加入12孔板，轻轻搅拌板以覆盖所有细胞，确保其染色。在18摄氏度下孵育30分钟。
然后去除铲渍溶液，将 PBS 中 4% 的 4% 的半成甲醛溶液中 300 微升，修复细胞。轻轻搅拌 15 分钟。之后，在PBS中清洗固定细胞三次。
上次洗涤后保持 PBS，以保持细胞覆盖。打开荧光显微镜硬件，包括汞灯电源、荧光灯电源和 PC。登录到操作系统帐户，启动软件，并检查其配置。将准备好的板放在显微镜舞台上。
使用舞台控制器将样品放置在目标透镜上。在光学显微镜下找到感兴趣的细胞。切换到荧光显微镜，将激发和发射参数分别调整到约352纳米和461纳米，用于核DNA观察。
捕获图像。本研究建立和传递了海参的原发性肠道细胞培养。此处显示了不同培养阶段的圆形细胞。
这里是在第三天，种子后附着在盘子底部的细胞。这里是第七天的细胞增殖。这是传传后附着在盘子底部的细胞。
和细胞失去活性，并在10个通道后死亡。EDU 说明分析提供直接证据，揭示这些圆形细胞在后期阶段的增殖活性。与对照和100微摩尔德西梅萨酮刺激相比，使用一微摩尔德西美沙酮的刺激以更快的速度增加凋亡细胞速率。
培养细胞在不同时间段内用德西梅萨酮进行处理，随后进行33258染色，用于凋亡细胞检测。孵化前的细胞治疗对长期控制至关重要。当单元格增长不好时，可以提醒尝试可选的简化协议。
副甲醛通过皮肤接触或吸入而具有中度毒性，并记录为可能为人类致癌物质。
