Le protocole fournit une méthode de culture cellulaire primaire facile à manipuler et largement compatible pour les invertébrés marins. Cette technique donne aux chercheurs un moyen de culturer les cellules invertébrées marines pendant relativement longtemps. Une culture des cellules devrait être fournie avec le fond génétique cohérent pour différentes autres applications expérimentales biologiques dans la recherche marine de biologie.
Pour la nouvelle recherche dans ce domaine, nous croyons que le protocole simplifié indiqué devrait être le bon choix à exercer. Après l’anesthésie, disséquer et recueillir les intestins antérieurs, puis sectionner les échantillons de tissu verticalement et enlever le contenu intérieur. Lavez les échantillons de tissus en PBS deux fois et désinfectez-les par immersion dans une solution à 75 % d’éthanol pendant au plus deux secondes.
Ensuite, lavez les échantillons de tissu dans PBS trois fois pour enlever l’éthanol, et transférer environ 100 milligrammes d’échantillon de tissu dans un tube stérile de micro centrifugeuse de deux millilitres. Ajouter 1,5 millilitres de milieu de culture pré-optimisé au bloc de tissu intestinal du concombre de mer et hacher le bloc avec des ciseaux chirurgicaux stérilisés jusqu’à ce que la solution soit trouble. Ajouter 400 microlitres de trypsine de 0,25%.
Mélanger la solution par inversion et l’incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Filtrez ensuite la solution à l’aide d’une passoire cellulaire de 100 microns et recueillez le filtrate dans un nouveau tube stérile de micro centrifugeuse de deux millilitres. Pour un protocole simplifié facultatif, les blocs tissulaires coupés dans des supports cultivés peuvent être directement transférés dans la vaisselle et ensuite incubés.
Centrifuger le tube à 1700xG pendant trois minutes, jeter le supernatant, puis re-suspendre la pastille dans le milieu de la culture avec des antibiotiques, et le laver avec le milieu de la culture deux fois. Prédécez l’incubateur pour la culture cellulaire, et exécutez-le à l’avance pendant au moins 24 heures avec la température de 18 degrés Celsius et l’humidité saturée. Puis re-suspendre les cellules à l’aide de 200 microlitres de milieu indiqué, et les transférer dans des plats de quatre centimètres.
Culture des cellules dans un incubateur. Après six heures, sortez-les de l’incubateur et ajoutez deux millilitres de milieu indiqué aux plats de culture cellulaire. Toutes les 12 heures, changer la moitié du milieu.
Après cinq à sept jours, les cellules commencent à se diviser. Réduire de moitié les effets néfastes des antibiotiques en réduisant de moitié la concentration d’antibiotiques indiqués, de pénicilline, de streptomycine et de gentamicine dans le milieu de la culture. Tous les deux à trois jours, remplacer le milieu de culture cellulaire.
Lorsque la densité cellulaire primaire atteint 60%, conduire le passage cellulaire. Tout d’abord, laver les cellules de culture deux fois en utilisant PBS à température ambiante. Ajouter 200 microlitres de solution trypsine de 0,25% à chaque plat, et agiter manuellement la vaisselle, en veillant à ce que tout le fond soit couvert.
Jetez la solution de trypsine et incubez les cellules pendant cinq minutes à température ambiante. Lavez les cellules avec un millilitre de milieu de culture frais en pipetage et en suspendant à nouveau les cellules. Transférer 0,5 millilitres de suspension cellulaire dans un nouveau plat.
Ajouter 1,5 millilitres de milieu frais et incuber les cellules à 18 degrés Celsius. Après 12 heures, changer le milieu, et observer les cellules sous un microscope pour évaluer les conditions. Préparez trois groupes expérimentaux, dont un contrôle, et deux groupes de solutions, avec un micromolaire et 100 micromolaires deximethazone.
Après incubation avec ou sans deximethazone pendant zéro, 24 ou 48 heures, lavez les cellules trois fois avec PBS. Après avoir éteint la lumière, ajouter 300 microlitres de hoechst 33258 solution par puits à une plaque de 12 puits, et agiter doucement la plaque pour couvrir toutes les cellules, assurant leur coloration. Incuber à 18 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Retirez ensuite la solution de coloration hoechst et fixez les cellules en ajoutant 300 microlitres de solution de paraformaldéhyde de quatre pour cent dans PBS à chaque puits. Agiter doucement pendant 15 minutes. Après cela, laver les cellules fixes trois fois dans PBS.
Gardez le PBS après le dernier lavage pour garder les cellules couvertes. Allumez le matériel du microscope fluorescent, y compris la puissance de la lampe au mercure, la puissance de la lumière fluorescente et le PC. Connectez-vous au compte du système d’exploitation, lancez le logiciel et vérifiez sa configuration. Placez la plaque préparée au microscope.
Placez l’échantillon au-dessus de la lentille objective à l’aide du contrôleur de scène. Trouvez les cellules d’intérêt sous le microscope à lumière. Passez à la microscopie fluorescente et ajustez les paramètres de l’excitation et de l’émission à environ 352 et 461 nanomètres, respectivement, pour l’observation de l’ADN des noyaux.
Capturez les images. Dans cette étude, la culture intestinale primaire de cellules du concombre de mer a été établie et passage. Les cellules rondes à différents stades de la culture sont montrées ici.
Voici les cellules attachées au fond des plats le troisième jour, après avoir été ensemencées. Voici la prolifération cellulaire le septième jour. Voici les cellules attachées au fond de la vaisselle après la passaging.
Et les cellules qui ont perdu l’activité et mouraient après 10 passages. Les analyses indiquant eDU fournissent des preuves directes pour révéler l’activité proliférative de ces cellules rondes dans les étapes ultérieures. La stimulation avec un deximethazone micromolaire a augmenté le taux de cellules apoptotiques le plus rapidement, par rapport à la commande et la stimulation de 100 micromolaires deximethazone.
Les cellules de culture ont été traitées avec deximethazone pendant différentes périodes de temps, suivies de la coloration hoechst 33258 pour la détection de cellules apoptotiques. Les traitements cellulaires avant l’incubation sont essentiels pour le contrôle à long terme. C’est un rappel d’essayer le protocole simplifié facultatif lorsque la cellule ne se développe pas bien.
Le paraformaldéhyde est modérément toxique par contact avec la peau ou par inhalation, et il est documenté comme étant probablement cancérogène pour l’homme.
