Протокол обеспечивает простой в обращении и широко совместимый метод культуры первичных клеток для морских беспозвоночных. Этот метод дает исследователям способ культуры морских беспозвоночных клеток в течение сравнительно длительного времени. Культура клеток должна быть обеспечена последовательным генетическим фоном для различных дальнейших биологических экспериментальных применений в исследованиях морской биологии.
Что мы считаем, что для новых исследований в этой области указанный упрощенный протокол должен быть хорошим выбором для осуществления. После обезболировки, вскрывать и собирать передний кишечник, затем раздел образцов ткани вертикально и удалить внутреннее содержимое. Вымойте образцы тканей в PBS дважды и дезинфицировать их путем погружения в 75%ethanol раствор не более двух секунд.
Затем мыть образцы тканей в PBS три раза, чтобы удалить этанол, и передать около 100 миллиграммов образца ткани в два миллилитров стерильных микро центрифуг трубки. Добавьте 1,5 миллилитров предварительно оптимизированной среды культуры в блок кишечной ткани морского огурца и измельчите блок стерилизованными хирургическими ножницами до тех пор, пока раствор не будет мутным. Добавьте 400 микролитров 0,25% трипсина.
Смешайте раствор инверсией и инкубировать его в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем отфильтруйте раствор с помощью 100 микрон-клеточного ситечко и соберите фильтрат в новой стерильной двухмилитровой микро центрифуге. Для факультативного упрощенного протокола блоки тканей, разрезанные в культурных средствах массовой информации, могут быть непосредственно переданы в посуду и впоследствии инкубированы.
Центрифуга трубки на 1700xG в течение трех минут, отказаться от супернатанта, а затем вновь приостановить гранулы в среде культуры с антибиотиками, и мыть его с культурой среды в два раза. Предварительно установите инкубатор для клеточной культуры, и запустить его заранее, по крайней мере 24 часов с температурой 18 градусов по Цельсию и насыщенной влажности. Затем повторно приостанавливайте клетки с помощью 200 микролитров указанной среды и перенесите их в четырехметровые блюда.
Культура клеток в инкубаторе. Через шесть часов вывихните их из инкубатора и добавьте два миллилитров указанной среды в клетку, культивируя блюда. Каждые 12 часов меняй половину среды.
Через пять-семь дней клетки начинают делиться. Уменьшите неблагоприятное воздействие антибиотиков за счет снижения концентрации указанных антибиотиков, пенициллина, стрептомицина и гентамицина в среде культуры в два раза. Каждые два-три дня, заменить клеточной культуры среды.
Когда плотность первичной клетки достигает 60%, проводится пропуск клеток. Во-первых, мыть культурные клетки в два раза с помощью PBS при комнатной температуре. Добавьте 200 микролитров 0,25%трипсина раствора к каждому блюду, и вручную агитировать блюда, гарантируя, что все дно покрыто.
Откажитесь от трипсина раствор, и инкубировать клетки в течение пяти минут при комнатной температуре. Вымойте клетки одним миллилитром свежей среды культуры путем пипетки и повторной приостановки клеток. Перенесите 0,5 миллилитров клеточной подвески на новое блюдо.
Добавьте 1,5 миллилитров свежей среды и инкубировать клетки при 18 градусах Цельсия. Через 12 часов, изменить среду, и наблюдать клетки под микроскопом, чтобы оценить условия. Подготовьте три экспериментальные группы, включая контроль, и две группы решений, с одним микромолярем и 100 микромоляной дексиметазон.
После инкубации с или без дексиметазона для нуля, 24, или 48 часов, мыть клетки три раза с PBS. После выключив свет, добавьте 300 микролитров раствора hoechst 33258 на колодец в 12 хорошо пластины, и осторожно агитировать пластины, чтобы покрыть все клетки, обеспечивая их окрашивание. Инкубировать при 18 градусах по Цельсию в течение 30 минут.
Затем удалите раствор окрашивания hoechst и исправить клетки, добавив 300 микролитров четырехпроцентного раствора параформальдегида в PBS к каждой хорошо. Аккуратно агитировать в течение 15 минут. После этого, мыть фиксированные клетки три раза в PBS.
Держите PBS после последнего мытья, чтобы держать клетки покрыты. Включите аппаратное обеспечение флуоресцентного микроскопа, включая мощность ртутной лампы, люминесцентную световую силу и ПК. Войдите в учетную запись операционной системы, запустите программное обеспечение и проверьте его конфигурацию. Поместите подготовленную тарелку на сцену микроскопа.
Распоить образец над объективом цели с помощью сценического контроллера. Найти клетки, представляющие интерес под световым микроскопом. Переключитесь на флуоресцентную микроскопию и отрегулируйте параметры возбуждения и выброса примерно до 352 и 461 нанометров, соответственно, для наблюдения ДНК ядер.
Захват изображений. В этом исследовании была установлена и проходная культура первичных кишечных клеток морских огурцов. Здесь показаны круглые клетки на разных стадиях культивирования.
Вот клетки, прикрепленные к нижней части блюд на третий день, после того, как посеяны. Вот распространение клеток на седьмой день. Вот клетки, прикрепленные к нижней части посуды после прохода.
И клетки, которые потеряли активность и умирали после 10 проходов. EDU заявив, анализы предоставляют прямые доказательства, чтобы выявить пролиферативную активность этих круглых клеток на более поздних стадиях. Стимуляция с помощью одного микромолара дексиметазона увеличила скорость апоптотических клеток наиболее быстро, по сравнению с контролем и 100 микромоляной дексиметазонной стимуляцией.
Культурные клетки были обработаны с deximethazone для различных периодов времени, а затем hoechst 33258 окрашивания для обнаружения апоптотических клеток. Клеточное лечение перед инкубацией имеет решающее значение для долгосрочного контроля. Это напоминание, чтобы попробовать дополнительный упрощенный протокол, когда ячейка не растут хорошо.
Параформальдегид умеренно токсичен при контакте с кожей или вдыхании, и он задокументирован как, вероятно, канцероген человека.
