このプロトコルは、海洋無脊椎動物に対して扱いやすく、広く適合する一次細胞培養法を提供します。この技術は、研究者に海洋無脊椎動物細胞を比較的長い時間培養する方法を与える。細胞の培養は、海洋生物学研究における異なるさらなる生物学的実験アプリケーションのための一貫した遺伝的背景を提供されるべきである。
この分野の新しい研究では、示された簡略化されたプロトコルが行使する良い選択であるべきだと考えています。麻酔後、前腸を解剖して収集し、組織サンプルを垂直に切り離し、内部内容物を除去する。PBSで組織サンプルを2回洗浄し、75%エタノール溶液に2秒以内に浸漬して消毒します。
次いで、組織サンプルをPBSで3回洗浄してエタノールを除去し、約100ミリグラムの組織サンプルを2ミリリットルの無菌マイクロ遠心チューブに移した。ナマコの腸組織ブロックに1.5ミリリットルの事前に最適化された培養培地を加え、溶液が曇るまで滅菌された外科用ハサミでブロックをミンチします。0.25%トリプシンの400マイクロリットルを追加します。
溶液を反転で混ぜ、室温で5分間インキュベートします。次に、100ミクロンの細胞ストレーナーを使用して溶液を濾過し、新しい滅菌2ミリリットルマイクロ遠心チューブに濾液を収集します。任意の簡易プロトコルのために、培養された媒体で切断されたティッシュブロックは、直接皿に移され、その後インキュベートすることができる。
チューブを1700xGで3分間遠心し、上清を捨て、次いで抗生物質でペレットを培地中に再中断し、培養培地で2回洗浄する。細胞培養用インキュベーターをあらかじめ設定し、最低24時間、摂氏18度と飽和湿度で予め実行します。その後、示された培地の200マイクロリットルを使用して細胞を再中断し、4センチメートルの皿に移します。
培養器で細胞を培養する。6時間後、それらをインキュベーターから取り出し、示された培地の2ミリリットルを細胞培養皿に加えます。12時間ごとに、培地の半分を変更します。
5~7日後、細胞は分裂し始める。示された抗生物質、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびゲンタマイシンの濃度を培地中で半分に減らすことによって、抗生物質の副作用を軽減する。2~3日ごとに、細胞培養培地を交換する。
一次細胞密度が60%に達すると、細胞の通過を行う。まず、培養細胞を室温でPBSを用いて2回洗浄する。各皿に0.25%トリプシン溶液の200マイクロリットルを加え、手動で皿を攪拌し、底全体が覆われていることを確認します。
トリプシン溶液を捨て、室温で5分間培養します。1ミリリットルの新鮮な培養培地で細胞を洗浄し、細胞をピペット化し、再懸濁させます。新しい皿に細胞懸濁液の0.5ミリリットルを移す。
新鮮な培地を1.5ミリリットル加え、18°Cで細胞をインキュベートします。12時間後、培地を変え、顕微鏡下で細胞を観察し、その条件を評価した。コントロールを含む3つの実験グループと、1つのマイクロモルと100マイクロモルデシメタズンを含む2つの溶液グループを準備します。
デキシメタゾールの有無にかかわらず、ゼロ、24、または48時間のインキュベーション後、PBSで細胞を3回洗浄する。光を消した後、12ウェルプレートに1ウェルあたり300マイクロリットルのhoechst 33258溶液を加え、プレートを軽く攪拌してすべての細胞を覆い、染色を確実にします。摂氏18度で30分間インキュベートします。
次に、hoechst染色液を取り除き、各ウェルにPBSに4%パラホルムアルデヒド溶液の300マイクロリットルを加えて細胞を固定します。15分間静かに攪拌します。その後、固い細胞をPBSで3回洗浄する。
最後の洗浄後にPBSを保管し、細胞を覆い続けます。水銀灯パワー、蛍光灯パワー、PCなどの蛍光顕微鏡ハードウェアをオンにします。オペレーティング システム アカウントにログインし、ソフトウェアを起動し、その構成を確認します。準備したプレートを顕微鏡ステージに置きます。
ステージコントローラを使用して、サンプルを対物レンズの上に置きます。光学顕微鏡の下で目的の細胞を見つける。蛍光顕微鏡に切り替え、核DNA観察のために、励起および放出のパラメータをそれぞれ約352および461ナノメートルに調整します。
画像をキャプチャします。本研究では、ナマコの初代腸細胞培養が確立され、継代された。培養の異なる段階での丸い細胞がここに示されている。
ここでは、播種された後、3日目に皿の底に取り付けられた細胞があります。ここでは7日目の細胞増殖です。ここでは、合格後の皿の底に取り付けられた細胞があります。
そして、活動を失い、10の通過後に死んでいた細胞。EDU記載のアッセイは、後の段階でこれらの丸い細胞の増殖活性を明らかにするための直接的な証拠を提供する。1つのミクロモルデキシメタズンによる刺激は、コントロールおよび100マイクロモルデキシメタゾール刺激と比較して、アポトーシス細胞速度を最も急速に増加した。
培養細胞を異なる期間デシメタゾールで処理し、続いてアポトーシス細胞検出用にhoechst 33258染色を行った。インキュベート前の細胞治療は、長期制御にとって重要です。セルがうまく成長しない場合は、オプションの簡略化されたプロトコルを試してみることを思い出させるものです。
パラホルムアルデヒドは、皮膚接触または吸入によって適度に有毒であり、それはおそらくヒト発がん性物質として文書化されている。
