小鼠胚胎细胞的多路复用单细胞mRNA测序分析

单细胞mRNA测序被广泛用于了解单个细胞级别的生物过程。多路复用策略的出现进一步扩大了其放大，允许在单个实验中分析多个样本，从而大大降低了成本并避免了批处理效应。演示这个程序的将是魏峰，博士后，和安德鲁·普日辛达，一个技术员从我实验室。

计数后，将从胚胎18.5个心脏室分离出的细胞分成5倍10至第5个等分，每次洗涤用新鲜PBS洗两次细胞。每样品将颗粒重新加入 180 微升 PBS 中，并通过温和混合将 20 微升锚状条形码库存溶液添加到每个管中。在冰上孵育5分钟后，将20微升共锚条形码储存溶液加入每个管，轻轻混合，在冰上再孵育5分钟，然后用1毫升的冷PBS洗涤细胞三次，每次洗涤1%牛血清白蛋白，然后通过每管一个40微米细胞过滤器将样品过滤到新管中。

计数后，将芯片 B 组装到芯片支架中，然后在第一排未使用的油井中加入 75 微升 50%甘油溶液，在第二排未使用的油井中加入 40 微升，在第三排未使用的油井中加入 280 微升。请注意，此处使用训练芯片来演示该过程。通过温和的移液将适当的细胞悬浮液和无核酸酶水添加到主混合物中。

将生成的细胞溶液的 75 微升添加到样品井的底部中心，第一行没有气泡。Vortex 凝胶珠30秒，然后缓慢地将40微升珠添加到凝胶珠的底部中心，在第二排没有气泡。在第三排分区油井的侧壁上加入 280 微升的分区油。

将垫片连接到芯片上，无需按下垫片，且垫片保持水平，以避免弄湿垫片。在铬控制器中用垫片加载组装的芯片，并运行铬单单元B程序。请注意，屏幕显示训练芯片的铬训练，但对于实际实验，屏幕将显示铬单细胞B。

将盖子折回，以 45 度角露出油井，并检查液位，确保不存在堵塞。从回收液的最低点缓慢吸出乳液中的100微升凝胶珠，并检查珠子的均匀性。将乳化珠子从新的 PCR 管的墙壁上分配到冰上，然后将管放在热循环器中进行逆转录。

要准备cDNA进行扩增，在室温下将125微升的回收剂加入样品中。不应观察到不透明的液体，避免移液或涡流。等待 60 秒，然后慢慢从管底取出回收剂，并将 200 微升涡珠清洁混合物添加到样品中。

在室温下孵育10分钟之前，先将混合物移液10次。接下来，将样品放在高位置的磁铁上。当溶液清除时，去除上清液，并在颗粒中加入200微升80%乙醇。

30 秒后，取出乙醇并重复洗涤两次。上次洗涤后，将样品短暂离车，将管子放在磁体上的低位置，使样品风干不到两分钟。当样品干燥后，从磁铁上取出管子，并加入35.5微升新鲜制备的洗脱溶液。

在室温下孵育两分钟后，将样品放在磁铁的高位置，直到溶液清除，然后再将样品的35微升转移到新的管条上。对于使用脂质条形码策略的cDNA扩增，在短暂离心前，在35微升cDNA样品中加入扩增反应混合物，并进行彻底混合。在旋转结束时，按照适当的 cDNA 扩增过程在热循环器中孵育样品。

将 120 微升精选试剂和 100 微升超纯水添加到 100 微升样品中，并移液产生的 0.6 倍精选试剂 15 次。在室温下孵育五分钟后，将样品放在磁铁上，直到溶液变清。将上一液转移到 1.5 毫升低绑定管中，用于多路复用条码 cDNA 库结构。

请记住，当上清器的内容组装条形码cDNA和基物内生cDNA时，请同时保存超自然物质和碱基。用80%乙醇清洁内源性cDNA，用40微升洗脱缓冲液洗脱DNA，然后对内源性cDNA进行质量控制检查，然后准备内源性转录库。在库建设前，应量化和限定cDNA浓度。

构造的库，包括内生cDNA和条形码库，在测序之前也应该进行量化和限定。测序后，可以在每个单元中分析条形码表达式。例如，在此分析中观察到八组单细胞，它们唯一地表示一种类型的条形码，表示来自八个不同样本的细胞。

此外，一些单元格不表示任何条形码，因此被定义为负细胞，而其他单元格表示两个不同的条形码表示双精度。利用单细胞，可以通过细胞类型注释、新颖和稀有细胞类型识别、解剖区比较分析、基因本体通路分析（如细胞周期相分离）来评估细胞异质性和分子调控。如果可以，在乳液中成像凝胶珠是有帮助的，因为图像会告诉你手术是否成功到现在。

示例多路复用增加了设计实验的灵活性。看完这个演示，希望你们能更有信心开始自己的实验。