La secuenciación de ARNm de una sola célula se utiliza ampliamente para comprender los procesos biológicos a un solo nivel de célula. El advenimiento de las estrategias de multiplexación ha ampliado aún más sus amplificaciones al permitir el perfilado de múltiples muestras en un solo experimento, reduciendo drásticamente el costo y evitando los efectos de lote. Demostrando el procedimiento estarán Wei Feng, un postdoctorado, y Andrew Przysinda, un técnico de mi laboratorio.
Después de contar, divida las células aisladas del día embrionario 18,5 cavidades cardíacas en cinco veces 10 a las quintas alícuotas y lave las células dos veces con PBS fresco por lavado. Resuspender los pellets en 180 microlitros de PBS por muestra y añadir 20 microlitros de solución de material de código de barras de anclaje a cada tubo con mezcla suave. Después de una incubación de cinco minutos sobre hielo, agregue 20 microlitros de solución de material de barras de co-ancla a cada tubo con mezcla suave para una incubación adicional de cinco minutos sobre hielo antes de lavar las células tres veces con un mililitro de PBS frío complementado con 1%álbum de suero bovino por lavado, luego filtre las muestras en nuevos tubos a través de un colador de células de 40 micrometeres por tubo.
Después de contar, ensamble el chip B en un soporte de viruta, luego agregue 75 microlitros de una solución de 50% de glicerol a los pozos no utilizados en la fila uno, 40 microlitros a los pozos no utilizados en la fila dos, y 280 microlitros a los pozos no utilizados en la fila tres. Tenga en cuenta que aquí se utiliza un chip de entrenamiento para demostrar el procedimiento. Agregue el volumen adecuado de suspensión celular y agua sin nucleasas a la mezcla maestra con pipeteo suave.
Agregue 75 microlitros de la solución celular resultante al centro inferior de la muestra bien en la fila uno sin burbujas. Vórtice las perlas de gel durante 30 segundos antes de añadir lentamente 40 microlitros de cuentas al centro inferior del gel cuenta bien en la fila dos sin burbujas. Añadir 280 microlitros de partición de aceite por la pared lateral del pozo de aceite de partición en la fila tres.
Fije la junta al chip sin presionar la junta y manteniendo la junta horizontal para evitar mojar la junta. Cargue el chip montado con la junta en el controlador de cromo y ejecute el programa de celda b) de cromo. Tenga en cuenta que la pantalla muestra el entrenamiento de cromo para el chip de entrenamiento, pero para los experimentos reales la pantalla mostrará cromo de una sola celda B.Cuando el programa se haya completado, retire inmediatamente el chip y deseche la junta.
Doblar la tapa hacia atrás para exponer los pozos en un ángulo de 45 grados y comprobar los niveles de líquido para asegurarse de que no hay obstrucciones presentes. Aspirar lentamente 100 microlitros de perlas de gel en emulsión desde los puntos más bajos del pozo de recuperación y comprobar la uniformidad de las perlas. Dispensar las perlas emulsionadas por la pared de un nuevo tubo pcR sobre hielo y colocar el tubo en un ciclo térmico para la transcripción inversa.
Para preparar el ADNc para la amplificación, añada 125 microlitros de agente de recuperación a la muestra a temperatura ambiente. No se debe observar ningún líquido opaco y evitar pipeteo o vórtice. Espere 60 segundos antes de retirar lentamente el agente de recuperación de la parte inferior del tubo y agregue 200 microlitros de mezcla de limpieza de cuentas de vórtice a la muestra.
Pipetear la mezcla 10 veces antes de incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, coloque las muestras en un imán en la posición alta. Cuando la solución se despeje, retire el sobrenadante y agregue 200 microlitros de 80%etanol al pellet.
Después de 30 segundos, retire el etanol y repita el lavado dos veces más. Después del último lavado, centrifuga brevemente la muestra y coloque el tubo en el imán en la posición baja para permitir que la muestra se seque al aire durante menos de dos minutos. Cuando la muestra se haya secado, retire el tubo del imán y agregue 35,5 microlitros de solución de elución recién preparada.
Después de una incubación de dos minutos a temperatura ambiente, coloque la muestra sobre el imán en la posición alta hasta que la solución se despeje antes de transferir 35 microlitros de la muestra a una nueva tira de tubo. Para la amplificación de ADNc utilizando la estrategia de codificación de barras basada en lípidos, agregue la mezcla de reacción de amplificación a las muestras de ADNn. de 35 microlitilitros con una mezcla exhaustiva antes de centrifugar brevemente. Al final del giro, incubar la muestra en el ciclor térmico siguiendo el procedimiento de amplificación de ADNc adecuado.
Añada 120 microlitros de reactivo selecto y 100 microlitros de agua ultrapura a 100 microlitros de muestra y pipetee el reactivo de selección 0,6x resultante 15 veces. Después de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, coloque la muestra en el imán hasta que la solución quede clara. Transfiera el sobrenadante a un tubo de unión bajo de 1,5 mililitros para multiplexar la construcción de la biblioteca cDNA con código de barras.
Recuerde guardar tanto los sobrenadantes como la base como el contenido del sobrenadante ensamblan el cDNA con código de barras y el contenido base de ADNc endógeno. Limpie el ADNc endógeno con 80%etanol y eluda el ADN con 40 microlitros de tampón de elución, luego ejecute una comprobación de control de calidad del ADNc endógeno antes de preparar una biblioteca de transcripciones endógenas. La concentración de ADNc debe cuantificarse y calificarse antes de la construcción de la biblioteca.
Las bibliotecas construidas, incluidas las bibliotecas endógenas de ADNc y de códigos de barras, también deben cuantificarse y calificarse antes de la secuenciación. Después de la secuenciación, la expresión de código de barras se puede analizar en cada celda. Por ejemplo, en este análisis se observaron ocho grupos de celdas individuales que expresaban de forma única un tipo de código de barras que representaba celdas de ocho muestras diferentes.
Además, algunas celdas no expresaban ningún código de barras y, por lo tanto, se dentaban como celdas negativas, mientras que otras celdas expresaban dos códigos de barras diferentes que representaban dobletes. Usando las células singlete, la heterogeneidad celular y las regulaciones moleculares podrían evaluarse mediante anotación de tipo celular, identificación de tipo de célula nueva y rara, análisis comparativo de zonas anatómicas y análisis de vías de ontología genética, como separaciones de fase de ciclo celular. Es útil imaginar las cuentas de gel en emulsión si se puede, como una imagen le dirá si el procedimiento ha tenido éxito hasta este punto.
La multiplexación de ejemplo añade una gran flexibilidad en el diseño de sus experimentos. Después de ver esta demostración, espero que esté más seguro de comenzar sus propios experimentos.
