Одноклеточное секвенирование мРНК широко используется для понимания биологических процессов на уровне одной клетки. Появление мультиплексных стратегий еще больше расширило его усиление, позволив профилировать несколько образцов в одном эксперименте, резко сократив затраты и избегая эффектов партии. Демонстрация процедуры будет Вэй Фэн, постдок, и Эндрю Przysinda, техник из моей лаборатории.
После подсчета, разделить клетки изолированы от эмбрионального дня 18,5 сердечных камер в пять раз от 10 до пятого aliquots и мыть клетки два раза со свежим PBS за стирку. Resuspend гранулы в 180 микролитров PBS на образец и добавить 20 микролитров якорного штрих-кода фондового решения для каждой трубки с нежным смешивания. После пятиминутной инкубации на льду, добавьте 20 микролитров совместного якорного штрих-кода фондового раствора для каждой трубки с нежным смешиванием для дополнительной пятиминутной инкубации на льду перед мытьем клеток три раза с одним миллилитров холодного PBS, дополненного 1%бычьим альбумином сыворотки на стирку, затем фильтруйте образцы в новые трубки через одну 40-микрометровую камеру на трубку.
После подсчета, собрать чип B в держатель чипа, а затем добавить 75 микролитров 50% глицерол решение неиспользованных скважин в строке один, 40 микролитров для неиспользованных скважин подряд два, и 280 микролитров для неиспользованных скважин в строке три. Обратите внимание, что учебный чип используется здесь, чтобы продемонстрировать процедуру. Добавьте соответствующий объем клеточной суспензии и нуклеазной воды в мастер-микс с нежным пипетки.
Добавьте 75 микролитров полученного клеточного раствора в нижний центр образца и в ряд один без пузырьков. Vortex гель шарики в течение 30 секунд, прежде чем медленно добавить 40 микролитров бисера в нижней части геля шарик хорошо в строке два без пузырьков. Добавьте 280 микролитров перегородки масла вниз по боковине перегородки нефтяной аммии в строке три.
Прикрепите прокладку к чипу, не прижимая к прокладке и сохраняя прокладку горизонтальной, чтобы избежать смачивания прокладки. Загрузите собранный чип с прокладкой в контроллере хрома и запустите программу chromium single cell B. Обратите внимание, что экран показывает хром подготовки для обучения чип, но для реальных экспериментов экран будет отображать хрома одной ячейки B.When программа завершена, немедленно удалить чип и отказаться от прокладки.
Сложите крышку назад, чтобы разоблачить скважины под углом 45 градусов и проверить уровень жидкости, чтобы убедиться, что нет забивает присутствуют. Медленно аспирировать 100 микролитров гелеобразного бисера в эмульсии из самых низких точек восстановления хорошо и проверить однородность бисера. Разпределите эмульгифицированные бусы по стене новой трубки ПЦР на льду и поместите трубку в тепловой циклер для обратной транскрипции.
Для подготовки к цДНК для усиления добавьте в образец при комнатной температуре 125 микролитров восстановительного агента. Не следует соблюдать непрозрачную жидкость и избегать трубопроводов или вихрей. Подождите 60 секунд, прежде чем медленно удалить восстановительный агент из нижней части трубки и добавить 200 микролитров смеси очистки вихревого шарика в образец.
Pipette смесь 10 раз до инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем поместите образцы на магнит в высоком положении. Когда раствор очищается, удалите супернатант и добавьте в гранулы 200 микролитров 80% этанола.
Через 30 секунд снимите этанол и повторите стирку еще два раза. После последней стирки, кратко центрифуги образца и поместите трубку на магнит в низком положении, чтобы позволить образцу высохнуть менее чем за две минуты. Когда образец высохнет, снимите трубку с магнита и добавьте 35,5 микролитров свежеприготовленного раствора элюции.
После двухминутной инкубации при комнатной температуре поместите образец на магнит в высокое положение до тех пор, пока раствор не прояснит перед передачей 35 микролитров образца на новую трубчатую полосу. Для усиления cDNA с использованием стратегии штрихкодирования на основе липидов добавьте смесь реакции усиления к образцам 35-микролитрового кДНК с тщательным смешиванием перед краткой центрифугировкой. В конце спина инкубировать образец в тепловой циклер после соответствующей процедуры усиления cDNA.
Добавьте 120 микролитров отборного реагента и 100 микролитров ультрачистой воды в 100 микролитров образца и пипетки в результате 0,6x выберите реагент 15 раз. После пятиминутной инкубации при комнатной температуре поместите образец на магнит до тех пор, пока раствор не станет ясным. Перенесите супернатант на 1,5-миллилитровую трубку с низким уровнем связывания для мультиплексирования штрих-кодов здания библиотеки cDNA.
Не забудьте сохранить как supernatants и базы, как содержимое супернатанта собрать штрих-кодом cDNA и базовое содержимое эндогенных cDNA. Очистите эндогенный cDNA с 80% этанола и elute ДНК с 40 микролитров элюционного буфера, а затем запустить проверку качества эндогенных кДНК перед подготовкой эндогенной библиотеки стенограммы. Концентрация кДНА должна быть количественно оценена и квалифицирована до строительства библиотеки.
Построенные библиотеки, включая эндогенные библиотеки кДНК и штрих-кодов, также должны быть количественно оценены и квалифицированы до последовательности. После секвенирования выражение штрих-кода может быть проанализировано в каждой ячейке. Например, в этом анализе были замечены восемь групп одиночных ячеек, которые однозначно выразили один тип штрих-кода, представляющий клетки из восьми различных образцов.
Кроме того, некоторые ячейки не выражали штрих-кода и поэтому были определены как отрицательные клетки, в то время как другие ячейки выражали два разных штрих-кода, представляющих дублеты. Используя синглетные клетки, клеточная неоднородность и молекулярные правила могут быть оценены с помощью аннотации типа клетки, новой и редкой идентификации типа клеток, анатомического анализа зоны и анализа генно-онтологических путей, таких как разделение фазы клеточного цикла. Полезно, чтобы изображение гель бусы в эмульсии, если вы можете, как изображение скажет вам, является ли процедура была успешной до этого момента.
Мультиплексирование образцов добавляет большую гибкость в проектировании экспериментов. После просмотра этой демонстрации, я надеюсь, вы будете более уверены в начале собственных экспериментов.
