Die mRNA-Sequenzierung mit einzelligen Zellen wird häufig verwendet, um die biologischen Prozesse auf einer einzelnen Zellebene zu verstehen. Das Aufkommen von Multiplexing-Strategien hat seine Amplifikationen weiter erweitert, indem es die Profilerstellung mehrerer Proben in einem einzigen Experiment ermöglicht, die Kosten drastisch reduziert und die Batch-Effekte vermieden hat. Demonstriert wird das Verfahren von Wei Feng, einem Postdoc, und Andrew Przysinda, einem Techniker aus meinem Labor.
Nach dem Zählen die zellenisoliert vom embryonalen Tag 18,5 Herzkammern in fünf mal 10 bis die fünften Aliquoten und waschen Sie die Zellen zweimal mit frischen PBS pro Wäsche. Setzen Sie die Pellets in 180 Mikroliter PBS pro Probe wieder auf und fügen Sie 20 Mikroliter Anker-Barcode-Lagerlösung zu jedem Rohr mit sanftem Mischen hinzu. Nach einer fünfminütigen Inkubation auf Eis 20 Mikroliter Co-Anchor Barcode Stock Lösung zu jedem Rohr mit sanfter Mischung für eine zusätzliche fünfminütige Inkubation auf Eis hinzufügen, bevor Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter kalten PBS mit 1% Rinderserumalbumin pro Wäsche waschen, dann filtern Sie die Proben in neue Röhren durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb pro Tube.
Nach dem Zählen Chip B zu einem Spanhalter zusammenbauen und dann 75 Mikroliter einer 50%glyzerinlösung in die ungenutzten Brunnen in Reihe eins, 40 Mikroliter zu den ungenutzten Brunnen in Reihe zwei und 280 Mikroliter zu den ungenutzten Brunnen in Reihe drei hinzufügen. Beachten Sie, dass hier ein Trainingschip verwendet wird, um das Verfahren zu demonstrieren. Fügen Sie das entsprechende Volumen von Zellsuspension und nukleasefreiem Wasser in die Master-Mischung mit sanfter Pipettierung.
Fügen Sie 75 Mikroliter der resultierenden Zelllösung in die untere Mitte der Probe gut in Reihe eins ohne Blasen. Wirbeln Sie die Gelperlen für 30 Sekunden, bevor Sie langsam 40 Mikroliter Perlen in die untere Mitte der Gelperle gut in Reihe zwei ohne Blasen hinzufügen. Fügen Sie 280 Mikroliter Trennöl die Seitenwand des Trennölbrunnens in Reihe drei hinzu.
Befestigen Sie die Dichtung am Chip, ohne auf die Dichtung zu drücken und die Dichtung horizontal zu halten, um eine Benetzung der Dichtung zu vermeiden. Laden Sie den montierten Chip mit der Dichtung in den Chromregler und führen Sie das Chrom-Einzelzellen-B-Programm aus. Beachten Sie, dass der Bildschirm Chrom-Training für den Trainingschip zeigt, aber für die realen Experimente wird der Bildschirm Chrom-Einzelzelle B anzeigen. Wenn das Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie sofort den Chip und entsorgen Sie die Dichtung.
Falten Sie den Deckel zurück, um die Brunnen in einem 45-Grad-Winkel freizulegen, und überprüfen Sie den Flüssigkeitsstand, um sicherzustellen, dass keine Verstopfungen vorhanden sind. Langsam 100 Mikroliter Gelperlen in Emulsion von den tiefsten Punkten der Erholung gut aspirieren und die Gleichmäßigkeit der Perlen überprüfen. Geben Sie die emulgierten Perlen an der Wand eines neuen PCR-Rohrs auf Eis und legen Sie das Rohr in einen thermischen Cycler für die umgekehrte Transkription.
Um die cDNA für die Amplifikation vorzubereiten, fügen Sie der Probe 125 Mikroliter Wiederherstellungsmittel bei Raumtemperatur hinzu. Es sollte keine undurchsichtige Flüssigkeit beobachtet werden und Pipettieren oder Wirbel vermeiden. Warten Sie 60 Sekunden, bevor Sie das Wiederherstellungsmittel langsam von der Unterseite des Rohres entfernen und 200 Mikroliter Wirbelperlen-Reinigungsmischung in die Probe geben.
Pipette die Mischung 10 Mal vor der Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes legen Sie die Proben auf einen Magneten in der hohen Position. Wenn die Lösung abläuft, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie dem Pellet 200 Mikroliter 80% Ethanol hinzu.
Nach 30 Sekunden das Ethanol entfernen und das Waschen zwei weitere Male wiederholen. Nach der letzten Wäsche die Probe kurz zentrifugieren und das Rohr auf den Magneten in die niedrige Position legen, damit die Probe weniger als zwei Minuten trocknen kann. Wenn die Probe getrocknet ist, entfernen Sie das Rohr vom Magneten und fügen Sie 35,5 Mikroliter frisch zubereitete Elutionslösung hinzu.
Legen Sie die Probe nach einer zweiminütigen Inkubation bei Raumtemperatur in die hohe Position des Magneten, bis sich die Lösung entfernt, bevor Sie 35 Mikroliter der Probe auf einen neuen Rohrstreifen übertragen. Zur cDNA-Verstärkung mit der lipidbasierten Barcoding-Strategie fügen Sie den 35-Mikroliter-cDNA-Proben eine Amplifikationsreaktionsmischung mit gründlicher Durchmischung vor der kurzen Zentrifugierung hinzu. Am Ende des Spins die Probe im thermischen Cycler nach dem entsprechenden cDNA-Amplifikationsverfahren inkubieren.
Fügen Sie 120 Mikroliter ausgewähltere Reagenz und 100 Mikroliter Reinstwasser zu 100 Mikroliter Probe und Pipette das resultierende 0,6x ausgewählte Reagenz 15 Mal. Legen Sie die Probe nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur auf den Magneten, bis die Lösung klar wird. Übertragen Sie den Überstand auf ein 1,5-Milliliter-Low-Bind-Rohr für Multiplexing-Barcode-cDNA-Bibliotheksbau.
Denken Sie daran, sowohl die Überstandals als auch die Basis zu speichern, da der Inhalt des Überstandes barcoded cDNA und den Grundinhalt endogene cDNA zusammensetzt. Reinigen Sie die endogene cDNA mit 80% Ethanol und löschen Sie die DNA mit 40 MikroliterElutionspuffer, und führen Sie dann eine Qualitätskontrolle der endogenen cDNA durch, bevor Sie eine endogene Transkriptbibliothek vorbereiten. Die cDNA-Konzentration sollte vor dem Bibliotheksbau quantifiziert und qualifiziert werden.
Die konstruierten Bibliotheken, einschließlich der endogenen cDNA- und Barcode-Bibliotheken, sollten ebenfalls vor der Sequenzierung quantifiziert und qualifiziert werden. Nach der Sequenzierung kann der Barcodeausdruck in jeder einzelnen Zelle analysiert werden. In dieser Analyse wurden beispielsweise acht Gruppen von Einzelzellen beobachtet, die eindeutig einen Barcodetyp aus acht verschiedenen Proben exprimierten.
Darüber hinaus drückten einige Zellen keinen Barcode aus und wurden daher als negative Zellen definiert, während andere Zellen zwei verschiedene Barcodes ausdrückten, die Doublets darstellten. Anhand der Einzelzellen könnten die zelluläre Heterogenität und die molekularen Vorschriften anhand von Zelltyp-Anmerkungen, neuartiger und seltener Zelltyp-Identifikation, anatomischer Zonenvergleichsanalyse und Genontologie-Pfadanalyse, wie z. B. Zellzyklusphasentrennungen, beurteilt werden. Es ist hilfreich, die Gelperlen in Emulsion abzubilden, wenn Sie können, wie ein Bild Ihnen sagen wird, ob das Verfahren bis zu diesem Zeitpunkt erfolgreich war oder nicht.
Das Beispielmultiplexing bietet eine große Flexibilität beim Entwerfen Ihrer Experimente. Nachdem Sie sich diese Demonstration angeschaut haben, hoffe ich, dass Sie zuversichtlicher sein werden, Ihre eigenen Experimente zu starten.
