胃肠道有机体遗传工程的通用高效电穿孔协议

此方法能够有效转染 3D 细胞培养物，如器官。可以促进基因工程的各种应用。该协议是通用的，可以在一天内执行。

它不需要大量制备或特殊的、成本密集型的电穿孔缓冲液。这种转染方法在肿瘤和健康的器官中得到证明，但也可以适应球体和二D细胞培养。如果首次执行此协议，重要的是小心处理器官，因为它们的个体增殖和对分离的反应。

在整个过程中，对它们进行微观监控。首先在37摄氏度的温度下预热48孔板，用于电穿孔后播种，然后根据手稿方向准备基底和有机培养特定的介质。在48孔板中培育5口有机体，每井制备230微升分离试剂，每孔10微摩尔Y-27632。

在显微镜下监测器官。从井中去除培养介质，在准备好的分离混合物中机械分离有机体。将每个电穿孔样品的五口水池入一个 15 毫升管中。

通过涡旋混合管内的内容，在37摄氏度下孵育5至15分钟，直到出现10至15个细胞的簇，用显微镜检查分离。无需抗生素，就加入多达10毫升的基础介质，从而停止消化。将管子在450倍g下离心5分钟，丢弃上经剂，用四毫升电穿孔缓冲液清洗细胞两次。

每次洗涤后，离心机并丢弃上经剂。洗涤后，用30微克质粒DNA将有机体颗粒重新在100微升电穿孔缓冲液中。将完整的DNA-有机混合物分配到电穿孔盒中。

确保避免气泡。设置文本手稿中描述的电穿孔参数，然后用手指轻点电池以轻轻混合细胞。将保素放入保素室，然后按电穿孔器上的阻抗按钮，记下阻抗值。

按"开始"按钮启动电穿孔程序，并控制显示的电流、电压和能量的值。电穿孔后，立即在细胞中加入500微升无抗生素培养剂，通过上下移液混合。将样品转移到新的15毫升管中，用基底介质冲洗库维特，收集剩余的细胞，然后在室温下孵育细胞40分钟。

将细胞以450倍g离心5分钟，然后丢弃上看液。将颗粒重新在100微升的地下室基质中，将20微升的颗粒滴在预预热的48井板中。在37摄氏度下孵育板10分钟进行聚合，并添加250微升培养基，每井补充Y-27632和CHIR99021。

要确定转染效率，请在 24 至 48 小时后在显微镜下检查转染控制中的荧光。对于 FACS 分析，收集上述细胞并消化 10 到 20 分钟，直到单个细胞存在。加入多达10毫升的PBS，以450倍g离心细胞5分钟，然后吸气并丢弃上一代。

要区分活细胞，将颗粒重新在PBS的一毫升中，并加入合适的抗体或碘化钠。在黑暗中敲击并孵育细胞，轻轻混合细胞30分钟。孵育后，用10毫升PBS清洗细胞，然后离心并丢弃上经剂。

将细胞颗粒重新悬浮在 200 微升 PBS 中，并通过 100 微米滤株将悬浮液过滤到 FACS 管中。使用适当的浇注策略使用 FACS 机器分析细胞，并确定转染效率。四个不同癌症实体的有机体至少使用30微克的小质粒或大质粒进行电位分。

他们在电穿孔后48小时用流式细胞分析，并进行了细胞形状、单细胞、活细胞和eGFP表达的封闭分析。在所有四个器官实体中，小质粒的转染效率都高于较大的质粒。在具有92.1%GFP阳性细胞的PDAC器官中，小质粒的最有效的转染， 而大质粒的转染效率为46.7%较大的质粒更高效地转染成CRC器官，平均效率为53.4%，而小质粒的转染效率为84.3%，转染最困难的实体是胃癌器官，这显示了两个质粒最低的转染效率。

作为概念证明，人类正常的胃器官被电穿孔与质粒编码的Cas9，GFP和2sgRNA针对TP53。克隆由 Nutlin3 管理选择，TP53 淘汰通过等位基因的测序得到确认。正如我们用人类胃器官演示的，高效的电穿孔使各种CRISPR Cas9基操作器官培养物，如敲除或敲孔，因此可以模拟不同的疾病。