Этот метод обеспечивает эффективную трансфекцию 3D-клеточных культур, таких как органоиды. Различные применения генной инженерии могут быть облегчены. Протокол является универсальным и может быть выполнен в течение одного дня.
Он не нуждается в обширной подготовке или специальных, экономически интенсивных буферах электропорации. Этот метод трансфекции был продемонстрирован в опухоли и здоровых органоидов, но он может быть скорректирован на сфероиды и 2D-клеточной культуры, тоже. При выполнении этого протокола в первый раз, важно обращаться с органоидами с осторожностью из-за их индивидуального распространения и реакции на диссоциацию.
Мониторинг их микроскопически в течение всей процедуры. Начните с prewarming 48-хорошо пластин при 37 градусов по Цельсию для пост электропорации посева, а затем подготовить базальные и органоидные культуры конкретных средах в соответствии с рукописными направлениями. Выращивайте пять колодцев органоидов на образец электропорации в пластине 48 скважин, подготовьте 230 микролитров диссоциативного реагента с 10-микромолярной Y-27632 на скважину.
Мониторинг органоидов под микроскопом. Удалите культурную среду из колодцев и отмежевать органоиды механически в подготовленной диссоциации смеси. Бассейн пять скважин на образец электропорации в одну 15-миллилитровую трубку.
Смешайте содержимое трубки путем вихрей и инкубировать его в течение пяти-15 минут при 37 градусах по Цельсию, пока не возникнут кластеры от 10 до 15 клеток, проверяя диссоциацию с помощью микроскопа. Остановите пищеварение, добавив до 10 миллилитров базальной среды без антибиотиков. Центрифуга трубки в 450 раз г в течение пяти минут, отказаться от супернатанта, и мыть клетки в два раза с четырьмя миллилитров электропорации буфера.
Центрифуга и отказаться от супернатанта после каждой стирки. После мытья, resuspend органоидных гранул в 100 микролитров электропорации буфера с 30 микрограммов плазмидной ДНК. Вылейте полную ДНК-органоидную смесь в кюветт электропорации.
Убедитесь в том, чтобы избежать пузырьков воздуха. Установите параметры электропорации, описанные в текстовой рукописи, и коснитесь кюветта пальцем, чтобы аккуратно перемешать клетки. Поместите кювет в камеру cuvette и нажмите кнопку опоясыватель на электропораторе, чтобы сделать заметку о значении неуступучих.
Нажмите кнопку «Пуск», чтобы инициировать программу электропорации и контролировать значения отображаемых течений, напряжения и энергий. После электропорации, немедленно добавить 500 микролитров среды культуры без антибиотиков в клетки и перемешать путем пипетки вверх и вниз. Перенесите образец в новую 15-миллилитровую трубку и промойте кюветт базальной средой, чтобы собрать оставшиеся клетки, затем инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 40 минут.
Центрифуга клетки на 450 раз г в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Resuspend гранулы в 100 микролитров подвал матрицы и семян 20-микролитер капель в предварительной 48-хорошо пластины. Инкубировать пластину в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия для полимеризации и добавить 250 микролитров культуры среды дополнены Y-27632 и CHIR99021 на колодец.
Чтобы определить эффективность трансфекции, проверьте флуоресценцию в контроле трансфекции под микроскопом через 24-48 часов. Для анализа FACS, урожай клеток, как описано ранее и переварить в течение 10 до 20 минут, пока одиночные клетки присутствуют. Добавить до 10 миллилитров PBS и центрифуги клетки в 450 раз г в течение пяти минут, затем аспирировать и отказаться от супернатанта.
Чтобы дискриминировать живые клетки, опорообразуйте гранулы в один миллилитр PBS и добавьте подходящее антитело или йодидный пропидий. Аккуратно смешайте клетки, постукивая и инкубировать их при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте. После инкубации вымойте клетки 10 миллилитров PBS, затем центрифугу и отбросьте супернатант.
Перепройдите гранулы клетки в 200 микролитров PBS и фильтровать подвеску через 100-микрометровый ситечко в трубку FACS. Проанализируйте ячейки с помощью машины FACS, используя соответствующую стратегию гатинга и определите эффективность трансфекции. Органоиды четырех различных раковых образований были электропотезированы по крайней мере три раза с помощью 30 микрограммов небольшой плазмиды или большой плазмиды.
Они были проанализированы с цитометрией потока через 48 часов после электропорации и закрыты для формы клеток, одиночных клеток, живых клеток и экспрессии eGFP. Во всех четырех органоидных образованиях небольшая плазмида была трансфицирована с более высокой эффективностью, чем большая. Наиболее эффективная трансфекция малой плазмиды была достигнута в органоидах PDAC с 92,1%GFP-положительными клетками, в то время как большая плазмида была трансфицирована с эффективностью 46,7%Большая плазмида была более эффективно трансфицирована в органоиды CRC со средним эффективностью 53,4%, в то время как небольшая плазмида была трансфицирована со всей эффективностью 84,3%Самая трудная сущность для трансфекта были органоиды рака желудка , которая продемонстрировала самую низкую эффективность трансфекции для обеих плазмидов.
В качестве доказательства концепции, человека нормальный органоид желудка были электропотери с плазмидной кодирования для Cas9, GFP, и 2sgRNAs ориентации TP53. Клоны были выбраны администрацией Nutlin3, и нокаут TP53 был подтвержден секвенированием аллелей. Как мы показали с органоидами желудка человека, эффективная электропорация позволяет различные базовые манипуляции CRISPR Cas9 органоидных культур, таких как нокаут или стукины, так что различные заболевания могут быть смоделированы.
