이 방법은 오르가노이드와 같은 3D 세포 배양을 효율적으로 이식할 수 있습니다. 유전 공학의 다양한 응용 을 용이하게 할 수 있습니다. 프로토콜은 보편적이며 하루 이내에 수행 할 수 있습니다.
광범위한 준비 또는 비용 집약적인 전기 기공 버퍼가 필요하지 않습니다. 이러한 이식 방법은 종양 및 건강한 오르가노이드에서 입증되었지만 스페로이드 및 2D 세포 배양에도 조절될 수 있다. 처음으로 이 프로토콜을 수행하는 경우, 개별증식과 해리에 대한 반응 때문에 오르가노이드를 조심스럽게 처리하는 것이 중요합니다.
전체 절차 동안 현미경으로 모니터링합니다. 전기 포기 후 파종을 위해 섭씨 37도에서 48웰 플레이트를 예열한 다음 원고 방향에 따라 기저 및 오르가노이드 배양 별 매체를 준비합니다. 48웰 플레이트에서 전기 포기 샘플 당 5 개의 오르가노이드 를 재배하고 우물 당 10 마이크로 몰라 Y-27632로 230 마이크로 리터의 해리 시약을 준비합니다.
현미경으로 오르가노이드를 모니터링합니다. 우물에서 배양 배지를 제거하고 제조된 해리 혼합물에서 유기체를 기계적으로 분리한다. 전기포이션 샘플당 5개의 우물을 15밀리리터 튜브 하나로 풀링합니다.
10~15개의 세포의 클러스터가 발생할 때까지 튜브의 내용을 소용돌이에 섞고 섭씨 37도에서 5~15분 동안 배양하여 현미경으로 해리를 확인합니다. 항생제없이 기초 매체의 최대 10 밀리리터를 추가하여 소화를 중지하십시오. 5 분 동안 450 배 g에서 튜브를 원심 분리하고, 상류제를 버리고, 전기 기화 완충제의 4 밀리리터로 세포를 두 번 세척합니다.
원심 분리기와 매 세척 후 상체를 폐기하십시오. 세세액 후, 플라스미드 DNA 30 마이크로그램으로 100 마이크로리터의 전기기화 완충제에서 오르가노이드 펠릿을 재연한다. 완전한 DNA 오르간구성 혼합물을 전기기공큐벳에 분배합니다.
기포를 피하십시오. 텍스트 원고에 설명된 대로 전기 기화 매개변수를 설정하고 손가락으로 큐벳을 탭하여 셀을 부드럽게 섞습니다. 큐벳 챔버에 큐벳을 넣고 전기 포레이터의 임피던스 버튼을 눌러 임피던스 값을 기록합니다.
시작 버튼을 눌러 전기기 프로그램을 시작하고 표시된 전류, 전압 및 에너지의 값을 제어합니다. 전기화 후, 즉시 세포에 항생제없이 배양 배지의 500 마이크로 리터를 추가하고 위아래로 파이프팅하여 혼합. 샘플을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기고 기저 배지로 큐벳을 헹구어 나머지 세포를 수집한 다음 실온에서 40분 동안 세포를 배양합니다.
세포를 450배 g에서 5분간 원심분리하고 상체를 폐기합니다. 펠릿을 100 마이크로리터의 지하 매트릭스와 씨앗 20 마이크로리터드롭을 예온된 48웰 플레이트에 재차 펜슬을 재차 놓습니다. 중합을 위해 섭씨 37도에서 10분 동안 플레이트를 배양하고 Y-27632 및 CHIR99021로 보충된 배양 배지 250마이크로리터를 양적시한 것으로 보충한다.
경질 효율을 확인하려면 24~48시간 후에 현미경하에서 형광 제어의 형광을 확인한다. FACS 분석을 위해, 이전에 설명된 대로 세포를 수확하고 단 하나 세포가 존재할 때까지 10-20 분 동안 소화하십시오. PBS의 최대 10 밀리리터를 추가하고 5 분 동안 450 배 g에서 세포를 원심 분리 한 다음 흡인하고 슈퍼 나티얼을 폐기하십시오.
살아있는 세포를 차별하기 위하여는, PBS의 1 밀리리터에 펠릿을 재차 판하고 적당한 항체 또는 공화요오드를 추가합니다. 부드럽게 눌러 세포를 혼합하고 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 배양. 인큐베이션 후, PBS의 10 밀리리터로 세포를 씻은 다음 원심 분리기를 버리고 상퍼를 폐기하십시오.
PBS의 200 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 FACS 튜브로 100 마이크로 미터 여과기를 통해 서스펜션을 필터링합니다. 적절한 게이팅 전략을 사용하여 FACS 기계로 세포를 분석하고 형질 효율을 결정합니다. 4개의 다른 암 실체의 오르가노이드는 작은 플라스미드 또는 큰 플라스미드의 30 마이크로그램을 사용하여 적어도 3번 전기화되었다.
그(것)들은 전기화 후에 48 시간 유동 세포측정으로 분석하고 세포 모양, 단하나 세포, 살아있는 세포 및 eGFP 발현을 위해 문착되었습니다. 4개의 오르간성 실체에서, 작은 플라스미드는 더 큰 것보다 더 높은 효율로 전감염되었다. 작은 플라스미드의 가장 효율적인 트랜스페션은 92.1%의 GFP 양성 세포를 가진 PDAC 오르가노이드에서 도달했습니다, 대형 플라스미드는 46.7%의 효율로 전감염된 반면, 더 큰 플라스미드는 53.4%의 평균 효율로 CRC 오르가노이드로 보다 효율적으로 전감염되었으며, 작은 플라스미드는 평균 효율 84.3%로 전관된 반면, 트랜스펙트가 가장 어려운 실체는 위암 오르노이드였다. 두 플라스미드 모두에 대해 가장 낮은 경질 효율을 입증했습니다.
개념의 증거로, 인간의 정상적인 위 오르가노이드는 TP53을 대상으로 Cas9, GFP 및 2sgRNAs에 대한 플라스미드 인코딩으로 전기화되었다. 클론은 Nutlin3 투여에 의해 선택되었고 TP53 녹아웃은 알레일의 시퀀싱에 의해 확인되었다. 인간 위 오르가노이드로 입증된 바와 같이, 효율적인 전기포기는 녹아웃이나 녹틴과 같은 오르가노이드 배양의 다양한 CRISPR Cas9 베이스 조작을 가능하게 하므로 다른 질병을 모델링할 수 있습니다.
