Este método permite uma transfecção eficiente de culturas celulares 3D, como organoides. Várias aplicações da engenharia genética podem ser facilitadas. O protocolo é universal e pode ser realizado dentro de um dia.
Não precisa de uma preparação extensa ou de amortecedores de eletroporação especiais e intensivos em custos. Este método de transfecção foi demonstrado em tumores e organoides saudáveis, mas pode ser ajustado a esferoides e cultura celular 2D, também. Se realizar este protocolo pela primeira vez, é importante lidar com os organoides com cuidado devido à sua proliferação individual e reação à dissociação.
Monitore-os microscopicamente durante todo o procedimento. Comece por pré-aquecimento de 48 placas de 48 poços a 37 graus Celsius para semeadura pós-eletroporação, em seguida, prepare meios específicos da cultura basal e organoide de acordo com as instruções do manuscrito. Cultive cinco poços de organoides por amostra de eletroporação em uma placa de 48 poços, prepare 230 microliters de reagente de dissociação com 10-micromolar Y-27632 por poço.
Monitore os organoides sob um microscópio. Remova o meio de cultura dos poços e dissocia os organoides mecanicamente na mistura de dissociação preparada. Acumule cinco poços por amostra de eletroporação em um tubo de 15 mililitros.
Misture o conteúdo do tubo por vórtice e incuba-o por cinco a 15 minutos a 37 graus Celsius até que ocorram aglomerados de 10 a 15 células, verificando a dissociação com um microscópio. Pare a digestão somando 10 mililitros de meio basal sem antibióticos. Centrifugar o tubo a 450 vezes g durante cinco minutos, descartar o supernasce e lavar as células duas vezes com quatro mililitros de tampão de eletroporação.
Centrifugar e descartar o sobrenante após cada lavagem. Após as lavagens, resuspenque a pelota organoide em 100 microliters de tampão de eletroporação com 30 microgramas de DNA plasmídeo. Distribua a mistura DNA-organóide completa em uma cuvette eletroporação.
Certifique-se de evitar bolhas de ar. Defina os parâmetros de eletroporação conforme descrito no manuscrito do texto e toque na cuvette com um dedo para misturar suavemente as células. Coloque a cuvette na câmara de cuvette e pressione o botão de impedância no eletroporador para anotar o valor da impedância.
Pressione o botão Iniciar para iniciar o programa de eletroporação e controlar os valores das correntes, tensões e energias exibidas. Após a eletroporação, adicione imediatamente 500 microliters de meio de cultura sem antibióticos às células e misture por pipetação para cima e para baixo. Transfira a amostra para um novo tubo de 15 mililitros e enxágue o cuvette com meio basal para coletar as células restantes e, em seguida, incubar as células em temperatura ambiente por 40 minutos.
Centrifugar as células a 450 vezes g por cinco minutos e descartar o supernasce. Resuspend a pelota em 100 microliters de matriz de porão e sementes 20-microliter cai em uma placa pré-warmed 48-well. Incubar a placa por 10 minutos a 37 graus Celsius para polimerização e adicionar 250 microliters de cultura média suplementada com Y-27632 e CHIR99021 por poço.
Para determinar a eficiência da transfecção, verifique a fluorescência no controle de transfecção sob o microscópio após 24 a 48 horas. Para análise facs, colher as células como descrito anteriormente e digerir por 10 a 20 minutos até que as células únicas estejam presentes. Adicione até 10 mililitros de PBS e centrifugar as células a 450 vezes g por cinco minutos, depois aspire e descarte o supernascedor.
Para discriminar as células vivas, resuspensar a pelota em um mililitro de PBS e adicionar um anticorpo adequado ou iodeto de propídio. Misture suavemente as células tocando e incubando-as à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Após a incubação, lave as células com 10 mililitros de PBS, depois centrífuga e descarte o supernasce.
Resuspenja a pelota celular em 200 microliters de PBS e filtre a suspensão através de um filtro de 100 micrômetros em um tubo FACS. Analise as células com uma máquina FACS usando a estratégia de gating apropriada e determine a eficiência de transfecção. Organoides de quatro entidades diferentes do câncer foram eletroporados pelo menos três vezes usando 30 microgramas de um pequeno plasmídeo ou grande plasmídeo.
Foram analisadas com citometria de fluxo 48 horas após a eletroporação e fechadas para forma celular, células únicas, células vivas e expressão eGFP. Em todas as quatro entidades organoides, o pequeno plasmídeo foi transfeinado com maior eficiência do que o maior. A transfecção mais eficiente do pequeno plasmídeo foi alcançada em organoides PDAC com células positivas de 92,1% GFP, enquanto o grande plasmídeo foi transfecido com uma eficiência de 46,7%O plasmídeo maior foi mais eficientemente transfeinado em organoides CRC com uma eficiência média de 53,4%, enquanto o pequeno plasmídeo foi transfetado com uma eficiência média de 84,3% A entidade mais difícil de transerfeito foram organoides de câncer gástrico , o que demonstrou menor eficiência de transfecção para ambos os plasmídeos.
Como prova de conceito, os organoides estomacais normais humanos foram eletroporados com uma codificação plasmida para Cas9, GFP e 2sgRNAs visando TP53. Os clones foram selecionados pela administração Nutlin3 e o nocaute de TP53 foi confirmado pelo sequenciamento dos alelos. Como demonstramos com os organoides estomacais humanos, a eletroporação eficiente permite várias manipulações de base CRISPR Cas9 de culturas organoides, como nocautes ou knockins, para que diferentes doenças possam ser modeladas.
