使用无细胞细菌提取物、脂质体和乳液转移制备蛋白质生成合成细胞

蛋白质生产合成细胞提供了一个多功能的平台，用于研究生命的起源以及基于细胞的合成疗法，用于高级药物的输送。该方法简单且价格实惠，适用于RNA和蛋白质表达，可直接应用于体内的现场治疗蛋白生产。这些系统可用于治疗各种疾病，从代谢疾病和蛋白质替代到癌症和糖尿病。

此多步骤协议具有定义的停止点。首次执行时，建议将工作分成几天。合成细胞生产的协议始于无细胞S30-T7酸盐的制备。

接下来，膜脂质和细胞营养液准备模拟内部环境，并支持蛋白质生产。最后一步是合成细胞本身的准备。在 100 毫升 Erlenmeyer 烧瓶中准备重复的开胃培养物。

在每个烧瓶中，添加5毫升LB介质，每毫升安皮西林补充50微克，并接种单个大肠杆菌菌群。在 250 rpm 和 37 摄氏度的地板孵化器摇床中过夜地种植这种文化。接下来，准备两升困惑的 Erlenmeyer 烧瓶，含有 500 毫升的 TB 介质，并辅以每毫升安皮西林 50 微克。

接种每两升烧瓶与五毫升的开胃培养。在 250 rpm 和 37 摄氏度的转速下将烧瓶放在摇床中。使用分光光度计定期监测培养物，并在 0.8 和 1 之间将培养至 OD600。

要诱导T7RNA聚合酶表达，在每个烧瓶中加入三毫升100毫摩尔IPTG，达到0.6毫摩尔。继续种植培养，直到 OD600 大约四个。培养物达到所需的光学密度后，将悬浮液从每个 Erlenmeyer 烧瓶转移到两个 250 毫升灭菌离心管中。

在摄氏4度下，以7000倍g离心管，10分钟。丢弃上一杯。如果需要，使用搅拌器将每个颗粒在 250 毫升的冷 S30 lysate 缓冲液中重新使用。

在摄氏4度下以7000倍g离心10分钟。丢弃上清液，将所有颗粒重新在 15 毫升冷 S30 莱盐缓冲液中重新暂停。使用纱布垫过滤悬架。

在继续下一步之前，先将储存 lysate 所需的 1.5 毫升小瓶中的提示预冷。两次均匀化悬浮液。使用工作压力为 15，000 PSI，空气压力为 4 bar，可进行电池破裂。

收集同质。每10毫升均质悬浮液中加入100微升0.1摩尔DTT。在4摄氏度下30分钟将悬浮液在24，700次g下离心。

DTT 和氯仿被归类为刺激物和有害物，因此应谨慎处理。稍后在协议中使用的氯仿必须在具有烟气提取的区域使用。要保留 lysate 活动，请快速执行该步骤。

将200微升上清液等同物放在预冷却小瓶中，并立即用液氮捕捉冷冻。将小瓶存放在负 80 摄氏度，供将来使用。将氯仿中单独溶解波普克和胆固醇，最终浓度为每毫升100毫克。

分别旋转每个小瓶。将组件组合在两毫升玻璃瓶中。加入50微升的胆固醇-氯仿溶液、50微升的波普克-氯仿溶液和500微升的矿物油。

漩涡小瓶，然后蒸发氯仿，在80摄氏度的化学罩中加热约一小时。在开始合成细胞生产阶段之前，请准备手稿中描述的外层、预内和进料解决方案。然后将1.2毫升的外层溶液放在15毫升的管子中，然后慢慢从第一个玻璃瓶中加入一层500微升的脂质油溶液。

在室温下孵育管子20分钟。要完成内部溶液制备，通过添加S30-T7立质和DNA质粒，将冰混合到100微升的最终体积。将 100 微升内溶液与立盐和质粒添加到第二个两毫升玻璃瓶中，并加入 500 微升脂油溶液。

管道上下大力一分钟，然后漩涡在五级再旋一分钟。在碎冰上孵育所得乳液10分钟后，在15毫升管中缓慢地将乳液加入油相顶部。在100倍的g和4摄氏度下将管子离心10分钟。

然后在400倍的g和4摄氏度下离心10分钟。离心结束时，在管的底部应能观察到颗粒。要提取颗粒，请先清除多余的油层。

接下来，用大约 400 微升的外部溶液加载经过修剪的移液器尖端，并使用移液器尖端收集颗粒，当移液器尖端通过油相时释放外部溶液。擦拭移液器尖端，将颗粒转移到干净的 1.5 毫升管中。在1000倍的g和4摄氏度下将颗粒离心10分钟。

取出上一杯，将颗粒重新在100微升的进料溶液中。对于蛋白质表达，在37摄氏度下孵育悬浮液两小时，不摇晃。表达模型蛋白sfGFP和雷尼拉荧光素酶的质粒被引入无细胞蛋白合成、CFPS体积反应和合成细胞中。

使用几种方法对蛋白质生产进行评估。西方印迹分析检测到cfPS散装反应和合成细胞内的sfGFP His6生产。纯化 sfGFP His6 用作正对控件。

带光明场和 GFP 过滤器的荧光显微镜显示产生 sfGFP 的合成细胞。流细胞学用于分析产生合成细胞的sfGFP。活性合成细胞量的计算基于由红色直方图表示的负DNA样本定义的sfGFP荧光强度阈值。

从活性合成细胞组中计算出产生合成细胞的sfGFP平均荧光强度，并规范化为阴性DNA样本。根据sfGFP信号计算活性合成细胞的直径分布。用发光测量来量化雷尼拉荧光素酶活性。

该方法用途广泛，可以通过改变利盐原产、脂质成分和内部溶液浓度，针对不同的靶蛋白进行优化。可以对产生荧光标记蛋白的合成细胞进行FACS分析，以提供活性合成细胞分数的定量值。西方的印迹分析将测量蛋白质的产生。