합성 세포를 생산하는 단백질은 고급 약물 전달을 위한 합성 세포 기반 치료법뿐만 아니라 삶의 기원을 연구하기 위한 다목적 플랫폼을 제공합니다. 이 방법은 RNA 및 단백질 발현에 간단하고 저렴하며 신체 내부의 현장 치료 단백질 생산을 직접 적용할 수 있습니다. 이 시스템은 대사 질환과 단백질 대체에서 암 및 당뇨병에 이르기까지 광범위한 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다.
이 다단계 프로토콜에는 정의된 중지 지점이 있습니다. 처음으로 수행 할 때 며칠 동안 작업을 나누는 것이 좋습니다. 합성 세포 생산을 위한 프로토콜은 세포없는 S30-T7 용해물의 준비로 시작됩니다.
다음으로, 멤브레인 지질 및 세포 영양소 용액은 내부 환경을 시뮬레이션하고 단백질 생산을 지원할 준비가 되어 있습니다. 마지막 단계는 합성 세포 자체의 준비입니다. 100 밀리리터 에를렌마이어 플라스크에서 중복 스타터 문화를 준비합니다.
각 플라스크에, 암피실린의 밀리리터 당 50 마이크로 그램으로 보충 LB 미디어의 5 밀리리터를 추가하고 하나의 대장균 콜로니와 접종. 250 rpm과 섭씨 37도에서 바닥 인큐베이터 셰이커에서 하룻밤 문화를 성장. 다음으로, 암피실린 밀리리터 당 50 마이크로그램으로 보충된 500밀리리터의 결핵 매체를 함유한 두 리터 당황한 Erlenmeyer 플라스크를 준비합니다.
5 밀리리터 스타터 배양으로 두 리터 플라스크를 접종합니다. 플라스크를 셰이커에 250rpm과 섭씨 37도로 놓습니다. 분광계를 사용하여 주기적으로 배양을 모니터링하고 OD600이 0.8에서 1 사이까지 배양을 성장시다.
T7 RNA 폴리머라제 발현을 유도하기 위해, 각각의 플라스크에 100 밀리머 IPTG의 3밀리리터를 추가하여 0.6 밀리몰라에 도달한다. OD600이 약 4가 될 때까지 문화를 계속 성장시다. 배양이 원하는 광학 밀도에 도달하면 각 Erlenmeyer 플라스크에서 현탁액을 250 밀리리터 살균 원심분리기 튜브 2개로 옮기십시오.
4섭씨에서 10분 동안 7, 000배의 튜브원심분리. 상부체를 폐기합니다. 원하는 경우 교반기를 사용하여 차가운 S30 용해 버퍼의 250 밀리리터에서 각 펠릿을 다시 중단합니다.
섭씨 4도에서 10분 동안 7, 000배 g의 원심분리기. 상체를 버리고 차가운 S30 리세이트 버퍼의 15 밀리리터에서 모든 펠릿을 함께 재연하십시오. 거즈 패드를 사용하여 서스펜션을 필터링합니다.
다음 단계로 진행하기 전에 lysate를 저장하는 데 필요한 1.5 밀리리터 바이알에서 팁을 미리 식힙니다. 서스펜션을 두 번 균질화합니다. 세포 파손에 대한 4개의 막대의 기압으로 15, 000 PSI의 작동 압력을 사용합니다.
동종 모를 것을 수집합니다. 균질화 서스펜션의 10 밀리리터 당 0.1 어금니 DTT의 100 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 4도에서 30분에서 24, 700배의 현탁액을 원심분리합니다.
DTT와 클로로폼은 자극제와 유해로 분류되므로 주의하여 처리해야 합니다. 프로토콜의 나중에 사용되는 클로로폼은 연기 추출이 있는 영역에서 사용해야 합니다. lysate 활동을 유지하려면 단계를 신속하게 수행합니다.
미리 냉각된 바이알에 200마이크로리터 알리쿼트의 알라쿼트를 놓고 즉시 스냅하여 액체 질소로 동결합니다. 바이알을 음수 섭씨 80도에 저장하여 향후 사용하십시오. 별도로 MMC와 콜레스테롤을 클로로폼에 용해하여 밀리리터당 100밀리그램의 최종 농도를 기록합니다.
각 병병을 따로 소용돌이시다. 2 밀리 리터 유리 바이알에 구성 요소를 결합합니다. 콜레스테롤 클로로폼 용액 50마이크로리터, POPC-클로로폼 용액 50마이크로리터, 500마이크로리터의 미네랄 오일을 추가합니다.
유리병을 소용돌이, 다음 클로로폼을 증발, 화학 후드에 섭씨 80도에서 약 1 시간 동안 가열. 합성 세포 생산 단계를 시작하기 전에 원고에 설명된 바와 같이 외부, 사전 내부 및 공급 용액을 준비합니다. 그런 다음 15 밀리리터 튜브에 외부 용액1.2 밀리리터를 넣고 첫 번째 유리 바이알에서 500 마이크로리터의 지질 용액을 천천히 추가합니다.
실내 온도에서 20 분 동안 튜브를 배양하십시오. 내부 용액 준비를 마무리하려면 S30-T7 용액과 DNA 플라스미드를 추가하여 얼음을 100 마이크로리터의 최종 부피에 섞는다. 2밀리터 유리 바이알에 500 마이크로리터의 지질-인-오일 용액을 사용하여 내부 용액 100마이크로리터를 lysate 및 plasmid에 추가합니다.
파이펫은 1분 동안 힘차게 위아래로 내려가고 5레벨에서 1분간 소용돌이합니다. 분쇄된 얼음에 10분 동안 에멀젼을 배양한 후, 15밀리리터 튜브의 오일 위상 위에 에멀젼을 천천히 추가합니다. 100g과 섭씨 4도에서 10분 동안 튜브원심분리합니다.
그런 다음 원심 분리기는 400 g와 섭씨 4도에서 10 분 동안. 원심 분리가 끝날 때까지 펠릿은 튜브 의 바닥에서 관찰 할 수 있어야합니다. 펠릿을 추출하려면 먼저 과도한 오일 층을 제거하십시오.
다음으로, 약 400마이크로리터의 외부 용액으로 트리밍된 파이펫 팁을 로드하고 파이펫 팁을 사용하여 펠릿을 수집하여 파이펫 팁이 오일 단계를 통과할 때 외부 용액을 방출합니다. 파이펫 팁을 닦고 펠릿을 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브로 옮길 수 있습니다. 1, 000배, 섭씨 4도에서 10분 동안 펠릿원심분리합니다.
상체를 제거하고 100 마이크로리터의 수유 용액에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 단백질 발현의 경우 흔들림 없이 섭씨 37도에서 2시간 동안 현탁액을 배양합니다. 모델 단백질 sfGFP및 레닐라 루시파라제를 발현하는 플라스미드는 세포없는 단백질 합성, CFPS 대량 반응 및 합성 세포로 도입되었다.
단백질 생산은 여러 가지 방법을 사용하여 평가되었다. 서양 얼룩 분석은 CFPS 대량 반응과 합성 세포 내부에서 sfGFP His6 생산을 검출했습니다. 정제 된 sfGFP His6은 긍정적 인 제어로 사용되었다.
브라이트필드와 GFP 필터를 갖춘 형광 현미경은 sfGFP를 생성하는 합성 세포를 보여줍니다. 유동 세포측정은 합성 세포를 생성하는 sfGFP를 분석하는 데 사용되었습니다. 활성 합성 세포 집단의 계산은 적색 히스토그램으로 표현되는 음의 DNA 샘플에 의해 정의된 sfGFP 형광 강도 임계값을 기반으로 하였다.
합성 세포를 생성하는 sfGFP의 평균 형광 강도는 활성 합성 세포 집단으로부터 계산되고 부정적인 DNA 샘플로 정규화되었다. 활성 합성 세포의 직경 분포는 sfGFP 신호를 기반으로 계산되었다. Renilla luciferase 활동은 발광 측정으로 정량화되었습니다.
이 방법은 매우 다재다능하며 lysate 기원, 지질 조성 및 내부 용액 농도를 변경하여 다른 표적 단백질에 최적화 될 수 있습니다. 형광 마커 단백질을 생산하는 합성 세포의 FACS 분석은 활성 합성 세포의 분획의 정량적 가치를 제공하기 위해 수행 될 수있다. 서양 얼룩 분석은 단백질 생산을 측정할 것입니다.
