使用无细胞系统对用于蛋白质原型的最小线性模板进行扩增的快速酶促方法

该协议具有重要意义，因为它详细介绍了如何从合成设施接收的小基因片段中快速生成大量DNA模板以用于无细胞反应。滚动循环扩增可以比传统克隆更快地产生大量DNA。因此，它支持从合成DNA库构建更高通量的设计构建测试学习周期。

对于新用户来说，这些技术可能具有很大的固有可变性，因为需要许多步骤和少量操作。要认真注意技术，熟能生巧。首先，将PCR试剂盒中的所有组分加入单个PCR管中。

然后加入一微升重悬的基因片段。通过在介质设置下涡旋5至10秒，轻轻地均质混合物。根据试剂盒制造商的方案对热循环仪进行编程后，运行PCR。

完成PCR后，使用PCR纯化试剂盒从反应混合物中纯化DNA。在1.5毫升管中，以5：1的比例加入DNA结合缓冲液和PCR样品。将这种混合物转移到离心柱中，并以16， 000倍G离心一分钟。

丢弃流经。向色谱柱中加入200微升DNA洗涤缓冲液，并在室温下孵育一分钟。再次离心色谱柱并丢弃流出物。

如前所述，再次用DNA洗涤缓冲液洗涤色谱柱。丢弃第二次洗涤的流出物后，通过离心柱再离心一到两分钟来除去任何剩余的缓冲液。为了洗脱DNA，将色谱柱转移到新的1.5毫升管中。

然后将46微升双蒸馏水加入色谱柱中。孵育一分钟后，通过离心将DNA收集到管中。并使用分光光度计定量纯化的DNA。

为了消化和循环DNA，在PCR管中混合5微升必要的反应缓冲液，20个单位的HindIII限制性内切酶和45微升纯化的DNA。使用移液器，轻轻地使这种混合物均质化。然后将其在37摄氏度的热循环器中孵育15分钟。

孵育完成后，通过在80摄氏度下孵育20分钟，加热灭活HindIII酶。然后将5微升T4连接酶缓冲液和800单位的T4连接酶加入到新消化的DNA中。用移液器轻轻混合后，将混合物在25摄氏度下孵育一小时以进行循环反应。

反应完成后，使用PCR纯化试剂盒纯化DNA，如前所述。然后量化DNA。为了进行滚动循环扩增，将所有反应组分和一微升纯化的圆形表达模板结合在一个管中。

用移液管将混合物均质化，并将10微升的混合物等分到四个单独的管中。将试管在30摄氏度下孵育4至18小时，然后通过在65摄氏度下孵育10分钟来加热灭活酶。加热灭活后，通过在12摄氏度下孵育5分钟来鼓励管底部冷凝。

接下来，通过向每个管中加入15微升双蒸馏水来稀释所得溶液。如前所述，在纯化和定量DNA之前，结合每个管的内容物。为了进行无细胞反应，将各种所需的组分加入管中，并用双蒸馏水稀释至最终所需的体积。

通过上下移取一半的溶液10至20次来彻底混合溶液。将15微升等分试样的反应混合物转移到微量滴定板中的所需孔中。然后用无色密封膜密封板，以保持湿度并防止蒸发。

将密封板放入读板器中，让反应继续进行。如果使用无细胞系统表达枯草杆菌蛋白酶BPN基因，则在平底无色96孔板中等分94微升双蒸馏水和1微升10微摩尔PNA。然后加入五微升已完成的无细胞反应，并使用设置为每20秒测量410纳米吸光度的读板器读取板，持续10分钟，同时保持25摄氏度的温度。

在15微升反应中仅使用3微升未纯化的RCA DNA在BL21 DE3星提取物中表达的Superfolder GFP与PJL1质粒相当。将模板的量增加一倍和三倍似乎没有明显的好处，这表明模板的饱和水平已经达到每次反应3微升。相反，在使用随机应变细胞提取物时，增加RCA模板的数量似乎有好处。

需要较低温度或较长折叠时间的蛋白质会影响完成整个工作流程所需的时间。例如，在表达四小时后测定枯草杆菌蛋白酶会导致失败的结果，因为四小时不足以使枯草杆菌蛋白酶成熟。然而，允许反应持续16小时会导致可检测的枯草杆菌蛋白酶水平。

所有组件都需要充分混合，以使该协议以最高效率工作。按照这些方法，可以合成生成大量候选蛋白质库，然后以足够的产量表达以进行表征。这种方法为我们的小组开发可以在细胞提取物中工作的N C两个传感器铺平了道路，使我们能够快速表征原型蛋白。

这将使我们能够更快速，更智能地迭代新生物催化剂和疗法的蛋白质设计。