Protein üreten sentetik hücreler, yaşamın kökenlerinin yanı sıra gelişmiş ilaç dağıtımı için sentetik hücre bazlı tedavileri incelemek için çok yönlü bir platform sunar. Bu yöntem basit ve RNA ve protein ekspresyonu için uygun fiyatlı ve doğrudan vücut içinde yerinde terapötik protein üretimi için uygulanabilir. Sistemler, metabolik hastalıklarve protein replasmanlarından kansere ve muhtemelen diyabete kadar çok çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılabilir.
Bu çok adımlı protokolün tanımlanmış bir durma noktası vardır. İlk kez gerçekleştirirken, birkaç gün içinde çalışması bölmek için önerilir. Sentetik hücre üretimi protokolü hücresiz S30-T7 lysate hazırlanması ile başlar.
Daha sonra, membran lipidler ve hücresel besin çözeltisi iç çevre simüle etmek ve protein üretimini desteklemek için hazırlanmıştır. Son adım sentetik hücrelerin kendileri hazırlanmasıdır. 100 mililitrelik Erlenmeyer şişelerinde yinelenen başlangıç kültürleri hazırlayın.
Her şişe için, lb medya mililitre başına 50 mikrogram ampisilin ve tek bir E.coli kolonisi ile aşılama ile takviye ile takviye beş mililitre ekleyin. 250 rpm ve 37 santigrat derece bir zemin kuvöz shaker bir gecede kültür büyümek. Daha sonra, ampisilin mililitre başına 50 mikrogram ile desteklenen 500 mililitre TB medya içeren iki litre şaşkın Erlenmeyer şişeleri hazırlayın.
Her iki litrelik şişeyi beş mililitrelik başlangıç kültürüyle aşılama. 250 rpm ve 37 derece santigrat bir shaker şişeleri yerleştirin. Kültürleri bir spektrofotometre kullanarak periyodik olarak izleyin ve 0,8 ile 1 arasında OD600'e kadar kültürleri büyütün.
T7 RNA polimeraz ekspresyonunu indüklemek için, her şişeye 0,6 milimolar ulaşmak için 100 milimolar IPTG'nin üç mililitresini ekleyin. OD600 yaklaşık dört olana kadar kültürleri büyütmeye devam edin. Kültürler istenilen optik yoğunluğa ulaştıktan sonra, her Erlenmeyer şişesinden süspansiyonu iki adet 250 mililitre sterilize santrifüj tüpüne aktarın.
Tüpleri 7,000 kez 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Supernatant atın. İstenirse bir stirrer kullanarak 250 mililitre soğuk S30 lysate tampon her pelet resuspend.
Santrifüj 7, 000 kez g 10 dakika boyunca dört santigrat derece. Supernatant atın ve soğuk S30 lysate tampon 15 mililitre birlikte tüm peletler resuspend. Süspansiyonu gazlı bez pedleri kullanarak filtreleyin.
Bir sonraki adıma geçmeden önce, lysate depolamak için gerekli olacak 1,5 mililitrelik şişeler ipuçları önceden soğutul. Süspansiyonu iki kez homojenize edin. Hücre kırılması için dört çubukluk bir hava basıncı ile 15.000 PSI çalışma basıncı kullanın.
Homojenleri topla. Homojenleştirilmiş süspansiyonun 10 mililitresine 10 0,1 molar DTT 100 mikrolitre ekleyin. Süspansiyonu 24, 700 kez g'de 30 dakikada 4 santigrat derecede santrifüj edin.
DTT ve kloroform tahriş edici ve zararlı olarak sınıflandırılır ve bu nedenle dikkatli tedavi edilmelidir. Protokolde daha sonra kullanılan kloroform duman ekstraksiyonu olan bir alanda kullanılmalıdır. Lysate etkinliğini korumak için adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin.
Önceden soğutulmuş şişelere 200 mikrolitre lik ekspon yerleştirin ve hemen sıvı nitrojenle dondurun. Şişeleri ileride kullanılmak üzere negatif 80 santigrat derecede saklayın. Ayrı ayrı mililitre başına 100 miligram son konsantrasyona kloroform POPC ve kolesterol eritin.
Girdap her şişe ayrı ayrı. Bileşenleri iki mililitrelik cam şişede birleştirin. Kolesterol-kloroform çözeltisi 50 mikrolitre, POPC-kloroform çözeltisi 50 mikrolitre ve mineral yağ 500 mikrolitre ekleyin.
Şişeyi girdap, sonra kloroformu buharlaştırmak için kimyasal bir başlıkta 80 santigrat derecede yaklaşık bir saat ısıtın. Sentetik hücre üretim aşamasına başlamadan önce, el yazmasında açıklandığı gibi dış, ön iç ve besleme çözeltilerini hazırlayın. Daha sonra 15 mililitrelik bir tüpe dış çözeltinin 1,2 mililitresini yerleştirin ve ilk cam şişeden 500 mikrolitre lik yağ çözeltisi ekleyin.
Tüpü oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. İç çözelti hazırlamayı sonuçlandırmak için, S30-T7 lysate ve DNA plazmidi ekleyerek 100 mikrolitrelik son bir hacimde buz üzerinde karıştırın. 500 mikrolitre yağ çözeltisi ile ikinci iki mililitrelik cam şişeye lysate ve plazmid ile iç çözeltinin 100 mikrolitresini ekleyin.
Pipet yukarı ve aşağı şiddetle bir dakika ve sonra beşinci seviyede bir dakika daha girdap. Emülsiyon emülsiyonunu ezilmiş buzüzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırdıktan sonra, 15 mililitrelik tüpteki yağ fazının üstüne emülsiyon ekleyin. Tüpü 100 kez g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.
Sonra 400 kez g ve dört derece santigrat 10 dakika santrifüj. Santrifüjsonunda, bir pelet tüpün alt kısmında gözlemlenebilir olmalıdır. Pelet ayıklamak için, ilk fazla yağ tabakası kaldırın.
Daha sonra, yaklaşık 400 mikrolitre dış çözelti ile kesilmiş bir pipet ucu yükleyin ve pipet ucu yağ fazı geçer gibi dış çözelti serbest, pelet toplamak için pipet ucu kullanın. Pipet ucunu silin ve peleti temiz 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Peleti 10 dakika 10 dakika 1, 000 kez g ve 4 santigrat derece santrifüj edin.
Supernatant çıkarın ve besleme çözeltisi 100 mikrolitre pelet resuspend. Protein ekspresyonu için süspansiyonu sallayarak 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. SfGFP ve Renilla luciferase modelini ifade eden plazmidler hücresiz protein sentezi, CFPS toplu reaksiyonları ve sentetik hücrelere sokuldu.
Protein üretimi çeşitli yöntemlerle değerlendirildi. Batı leke analizi hem CFPS toplu reaksiyonlarında hem de sentetik hücrelerin içinde sfGFP His6 üretimini saptmıştır. Saflaştırılmış sfGFP His6 pozitif kontrol olarak kullanılmıştır.
Brightfield ve GFP filtreli floresan mikroskop, sfGFP üreten sentetik hücreleri gösterir. Akış sitometrisi sentetik hücreler üreten sfGFP analiz etmek için kullanılmıştır. Aktif sentetik hücre popülasyonunun hesaplanması, kırmızı histogramla temsil edilen negatif DNA örneği ile tanımlanan sfGFP floresan yoğunluk eşiğine dayanıyordu.
Sentetik hücre üreten sfGFP'nin ortalama floresan yoğunluğu aktif sentetik hücre popülasyonundan hesaplanmış ve negatif DNA örneğine normalleştirilmiştir. Aktif sentetik hücrelerin çap dağılımları sfGFP sinyaline göre hesaplanmıştır. Renilla luciferase aktivitesi lüminesans ölçümleri ile ölçüldü.
Bu yöntem çok yönlüdür ve lysat menşei, lipid bileşimi ve iç çözelti konsantrasyonlarını değiştirerek farklı hedef proteinler için optimize edilebilir. Floresan marker proteini üreten sentetik hücrelerin FACS analizi, aktif sentetik hücrelerin fraksiyonunun nicel değerini sağlamak için yapılabilir. Batı leke analizi protein üretimini ölçer.
