使用免疫荧光显微镜鉴定帕芬-嵌入式猫动脉血栓中中性粒细胞外陷阱

这种抛物化协议，以及石蜡嵌入大动脉部分的抗原检索，是研究中性粒细胞三细胞陷阱在猫血栓形成中的作用的有用工具。通过固定和石蜡嵌入组织中的免疫荧光检测嗜中性粒细胞三细胞陷阱，优于常规组织支架（如 HNE），因为它允许同时检测更安全的DNA和细胞外蛋白。该协议可用于其他类型的血栓和其他兽医物种。

在猫动脉血栓中识别嗜中性粒细胞外陷阱表明，它们可能在猫的血栓形成中发挥作用。此处介绍的议定书是准则。我们强烈鼓励调查人员调整抗原检索过程的持续时间和条件，以产生令人满意的信号。

要使用自动化系统对玻璃幻灯片上的部分进行脱甲和再水化，请将玻璃滑梯放在机架中。在 100% 盐水中完全淹没三分钟。重复此步骤两次。

请勿在步骤之间冲洗。在室温下完全淹没在降低乙醇浓度中，每次三次，每次三分钟。完全在去水中潜水两分钟，再重复一次。

使用 TBST 处理后，将加热至 100 摄氏度的去化水填充储液罐。让蒸笼平衡 20 分钟。在热板上，以 pH 9.0 至 95 至 97 摄氏度加热含有 Tris 和 EDTA 的市售抗原检索溶液。

确保不煮沸。将滑轨完全在加热抗原回收溶液中，通过蒸笼继续应用外部加热20分钟。接下来，用 TBST 将幻灯片洗三次五分钟。

现在，将节放在阻塞缓冲区 1 中。在 30 至 50 rpm 的温和摇动下，在室温下孵育两小时。无需洗涤，立即将100微升稀释的兔子多克隆抗人类柠檬酸组蛋白H3抗体直接涂抹在幻灯片上。

在每个部分上放置盖滑，以便抗体混合物均匀分布。在4摄氏度下孵育12至16小时，轻轻摇动。之后，用 TBST 清洗幻灯片三次，每次五分钟。

要应用抗体，请使用移液器，均匀地分配与 Alexa Fluor 488 结合的 100 微升山羊抗兔抗体。用锡箔盖住幻灯片，在温和摇动下在室温下孵育幻灯片一小时。根据手稿用 TBST 清洗后，在温和摇动下在 4 摄氏度下孵育阻塞缓冲液 2 中的部分过夜。

防止光线。每次用 TBST 洗三次，每次五分钟。在温和摇动下，在室温下将阻塞缓冲器 3 中的截面阻塞两个小时。

如前文所述，用生物素提包龙兔抗人类嗜中性粒细胞弹性酶抗体孵育部分，在4摄氏度内孵育12至16小时。用 TBST 洗涤后，用 Alexa Fluor 594 Streptavidin 结合液孵化幻灯片，在室温下孵育一小时。之后，用TBST洗涤一次五分钟。

按照制造商的指示，将100微升的自动荧光淬火溶液混合物直接涂抹到各部分上一分钟。立即用 TBST 清洗幻灯片六次，每次 10 分钟。用 100 微升 300 纳米摩尔 DAPI 覆盖每张幻灯片，在黑暗中 5 分钟。

然后用TBST洗五次，每次三分钟。将一滴防淡安装介质直接涂抹在部分周围的玻璃滑梯上。将盖滑轻轻放在截面上，不产生任何气泡。

让样品在黑暗中在摄氏四度下过夜。要定位血栓，请沿着主动脉、主动脉分叉和每个女性动脉的长度进行颅骨扫描，使用相位对比显微镜，目标为 10 倍。首先检查使用DAPI通道的无细胞DNA部分，其激发速度为357和44纳米。

分别在德克萨斯州红色和绿色荧光蛋白通道上识别细胞外嗜中性粒细胞弹性酶和细胞外组蛋白H3。在整个图像采集过程中保持每个通道的一致曝光时间和增益，以避免像素强度饱和。中性粒细胞外陷阱是基于中性粒细胞弹性酶、细胞化组蛋白H3和无细胞DNA的共同定位。

使用血氧素和 eosin 染色， 和明亮的场显微镜， 猫动脉血栓由红血球， 白细胞， 纤维蛋白和血小板组成.内特以各种长度的深紫色线网络出现，这些线围绕着附近的红细胞和白细胞。利用该协议，免疫荧光显微镜揭示了由无细胞DNA、细胞外细胞细胞基酮H3和嗜中性粒细胞弹性酶组成的大量NET。

在免疫显微镜的相位对比中，血栓被定性为血管空间内的一个构造良好的结构。但是，在任何控制样本中未检测到血栓。此图显示了在 488 纳米波长上成像红细胞等凝块元素的深刻自流性。

免疫标签后短暂的自荧光淬火显著提高了蛋白质共定位和 NET 检测的灵敏度，即使在红细胞丰富的区域。固定持续时间影响某些抗原的免疫反应。我们建议固定不超过24小时，以标准脱水和石蜡嵌入。

或者，不含甲醇的对甲醛可用于通过甲醛氧化的甲酸和酮来限制伪影。为了防止使用来自同一物种的初级抗体时受到干扰，我们包括额外的阻断步骤，使二级抗体上剩余的结合位点饱和。研究者必须包括阴性对比，包括同型抗体、排除原抗体和免疫标记步骤以及无血栓的猫的生物对等。

血栓组织极限的自动流动可以锤击中性粒细胞外陷阱的微观识别。研究者可以使用远红色的荧光团来最大限度地减少荧光。该技术可成为研究其他兽医物种中嗜中性粒细胞外陷阱的宝贵工具。

这可以提供更好的理解血栓的病理生理学。