Этот протокол парафинизации с последующим поиском антигена парафин-встроенных аортальных секций может быть полезным инструментом для изучения роли нейтрофиловых трехклеточных ловушек в кошачьем тромбозе. Обнаружение нейтрофиловых трехклеточных ловушек путем иммунофторесценции в фиксированной и парафиновой ткани превосходит обычные гистологические стенты, такие как HNE, так как позволяет одновременно обнаруживать более безопасную ДНК и внеклеточные белки. Этот протокол может быть использован в других типах тромбов и в других ветеринарных видов.
Выявление нейтрофиловых внеклеточных ловушек в кошачьих артериальных тромбах позволяет предположить, что они могут играть определенную роль в тромбозе у кошек. Протоколы, представленные здесь, являются руководящими принципами. Мы настоятельно рекомендуем следователям скорректировать продолжительность и условия процесса поиска антигена, чтобы дать удовлетворительный сигнал.
Для использования автоматизированной системы для выполнения депарафинизации и регидратации секций на стеклянных горках поместите стеклянные горки в стеллажи. Погрузите полностью в 100 процентов солевой раствор в течение трех минут. Повторите этот шаг дважды.
Не смойте между ступенями. Погрузиться полностью в снижение концентрации этанола при комнатной температуре три раза в течение трех минут каждый. Полностью погрузиться в деионизированную воду на две минуты и повторить еще раз.
После лечения TBST, заполнить резервуар с деионизированной водой нагревается до 100 градусов по Цельсию. Разрешить пароход камеры для equilibrate в течение 20 минут. На тепловой плите нагрейте коммерчески доступный антигенный раствор, содержащий Tris и EDTA при рН от 9,0 до 95 до 97 градусов по Цельсию.
Убедитесь, что он не кипит. Suberge слайды полностью в подогревом антиген поиска раствора и продолжить применение внешнего отопления через пароход в течение 20 минут. Затем трижды мыть горки с помощью TBST в течение пяти минут.
Теперь поместите разделы в блокирующий буфер 1. Инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре при нежном раскачивание между 30 и 50 об/мин. Без стирки немедленно нанесите 100 микролитров разбавленного кролика на поликлональный анти-человеческий цитруллинированный гистон H3 антитела непосредственно на слайд.
Поместите крышку скольжения на каждом разделе, чтобы обеспечить равномерное распределение смеси антител. Инкубировать в течение 12 до 16 часов при четырех градусах по Цельсию с нежным качания. После этого, мыть слайды три раза с TBST в течение пяти минут каждый раз.
Чтобы применить антитела, используйте пипетку и равномерно распределите 100 микролитров козьего анти-кроличьего антитела, спряженного с Alexa Fluor 488. Обложка слайды с фольгой и инкубировать слайды в течение одного часа при комнатной температуре под нежным качания. После мытья с TBST в соответствии с рукописью, инкубировать разделы в блокировании буфера 2 ночь при четырех градусах по Цельсию под нежным качания.
Защитите от света. Мыть с TBST три раза в течение пяти минут каждый раз. Блокируйте секции в блокировании буфера 3, как это было сделано ранее при комнатной температуре в течение двух часов под нежным раскачивание.
Инкубировать разделы с биотином laded ployclonal кролика анти-человеческого нейтрофила эластазы антитела на четыре градуса по Цельсию в течение 12 до 16 часов, как описано ранее. После мытья с TBST инкубировать слайды с Alexa Fluor 594 Streptavidin Conjugate в течение одного часа при комнатной температуре. После этого, мыть с TBST один раз в течение пяти минут.
Нанесите 100 микролитров смеси раствора Autofluorescense непосредственно на секции в течение одной минуты по указанию производителя. Немедленно мыть горки с TBST шесть раз в течение 10 минут каждый раз. Обложка каждого слайда с 100 микролитров 300 наномолярных DAPI в течение пяти минут в темноте.
Затем мыть с TBST пять раз в течение трех минут каждый раз. Нанесите каплю антифадной крепления среды прямо на стеклянную горку, окружающую секцию. Поместите крышку скольжения мягко на раздел, не создавая никаких пузырьков.
Разрешить образцы для лечения в ночное время в темноте при четырех градусах по Цельсию. Чтобы найти тромби, сканирование черепно caudally по длине аорты, аортальной бифуркации и каждой фемеральной артерии с помощью фазовой контрастной микроскопии с 10x цели. Сначала изучите разделы для клеточной ДНК с помощью канала DAPI с возбуждением на 357 и 44 нанометров.
Определите внеклеточную нейтрофиловую эластазу и цитруллинированный гистон H3 на техасских красных и зеленых флуоресцентных белковых каналах соответственно. Поддержание последовательного времени экспозиции и прибыли каждого канала на протяжении всего приобретения изображений, чтобы избежать насыщения интенсивностью пикселей. Нейтрофиловые внеклеточные ловушки идентифицируются на основе совместной локализации нейтрофиловой эластазы, цитруллинированного гистона H3 и клеточной ДНК.
Используя гематоксилин и эозин пятно, а также яркую микроскопию, кошачьи артериальные тромбы состоят из красных кровяных телец, лейкоцитов, фибрина и тромбоцитов. NETs появились как сети темно-фиолетовых нитей различной длины, окружающих близлежащие эритроциты и лейкоциты. Используя этот протокол, микроскопия иммунофлюоресценции выявила большие агрегаты NETs, состоящие из клеточной ДНК, внеклеточной цитруллинированной гистона H3 и нейтрофиловой эластазы.
При фазовом контрасте в иммунной микроскопии тромб характеризовался как хорошо разграниченое строение в сосудистом пространстве. Тем не менее, тромби не были обнаружены ни в одном из контрольных образцов. Эта цифра демонстрирует глубокую аутофторесценцию элементов сгустка, таких как эритроциты, когда изображены на длине волны 488 нанометров.
Краткое затухание аутофторенсии после иммунолабеллинга значительно повышает чувствительность коализализации белка и обнаружения NET даже в районах с обилием эритроцитов. Длительность фиксации влияет на иммунореактивность некоторых антигенов. Мы рекомендуем фиксации в течение не более 24 часов номинальной обезвоживания и парафина встраивания.
Кроме того, параформальдегид без метанола может быть использован для ограничения артефакта фирмической кислотой и кетонами от окисления формальдегида. Чтобы предотвратить помехи при использовании первичных антител, происходящих из одного и того же вида, мы включили дополнительный блокирующий шаг, чтобы насытить все оставшиеся связывающие участки вторичными антителами. Исследователи должны включать негативный контроль, состоящий из изотипных антител, исключение либо первичных антител и иммуно-маркировки шаг и биологический контроль от кошек без тромбоза.
Аутофлюоресценция пределов тканей тромби может забить микроскопическую идентификацию нейтрофиловых внеклеточных ловушек. Следователь может свести к минимуму флуоресценцию с помощью далеко-красных флюорофоров. Этот метод может быть ценным инструментом для изучения нейтрофиловых внеклеточных ловушек у других ветеринарных видов.
Это может обеспечить лучшее понимание патофизиологии тромбоза.
