パラフィン化のこのプロトコルは、パラフィンに続いてパラフィン化し、パラフィン埋め込まれた大動脈切片の抗原検索を行い、ネコ血栓症における好中球三細胞トラップの役割を研究するのに有用なツールであり得る。固定およびパラフィン埋め込み組織における免疫蛍光による好中球三細胞トラップの検出は、HNEのような従来の組織学的ステントより優れているため、より安全なDNAと細胞外タンパク質の同時検出が可能である。このプロトコルは、他のタイプの血栓および他の獣医種で使用することができる。
ネコの動脈血栓中の好中球外細胞トラップの同定は、猫の血栓症に役割を果たす可能性があることを示唆している。ここで示すプロトコルはガイドラインです。我々は、研究者が抗原検索プロセスの持続時間及び条件を調整し、満足のいくシグナルを生み出すことを強く推奨する。
自動システムを使用して、ガラススライド上のセクションの脱パラフィン化と再水和を実行するには、ガラススライドをラックに配置します。3分間100パーセント生理文で完全に水没します。この手順を 2 回繰り返します。
ステップ間でリンスしないでください。室温で3回、3分間、エタノール濃度を減少させて完全に沈水します。2分間脱イオン水に完全に沈み、もう一度繰り返します。
TBSTで処理した後、100°Cに加熱脱イオン水で貯水池を充填します。蒸気室を20分間平衡させます。ヒートプレート上で、TrisとEDTAを含む市販の抗原検索溶液をpH 9.0〜95〜97°Cで加熱します。
沸騰しないようにしてください。熱い抗原の検索の解決のスライドを完全にスベルジュし、20分間、蒸し器を介して外部加熱の適用を続ける。次に、スライドをTBSTで3回5分間洗います。
次に、ブロックバッファ1にセクションを配置します。30~50rpmの穏やかな揺れ下で室温で2時間インキュベートします。洗浄せずに、すぐに100マイクロリットルの希釈ウサギポリクローナル抗ヒトシトルリン化ヒストンH3抗体をスライドに直接塗布する。
各セクションにカバースリップを置き、抗体混合物の均等な分布を可能にする。穏やかな揺れで摂氏4度で12〜16時間インキュベートします。その後、スライドをTBSTで3回洗い、毎回5分間洗います。
抗体を適用するには、ピペットを使用し、アレクサFluor 488に結合したヤギ抗ウサギ抗体の100マイクロリットルを均等に配布します。スズ箔でスライドを覆い、穏やかな揺れの下で室温で1時間スライドをインキュベートします。原稿によるとTBSTで洗浄した後、緩やかな揺れ下で摂氏4度で一晩ブロッキングバッファ2にセクションをインキュベートする。
光から保護します。TBSTで3回5分間洗います。緩やかな揺れ下で2時間室温で行われたようにブロッキングバッファ3のセクションをブロックします。
先に説明した4°Cの抗ヒト好中球エラスターゼ抗体をビオチン・ラッド・プロイクローナル・エラスターゼ抗体で12〜16時間インキュベートする。TBSTで洗浄した後、室温で1時間アレクサフルーオール594ストレプトアビジンコンジュゲートでスライドをインキュベートします。その後、TBSTで1回5分間洗います。
100マイクロリットルのオートフルオレセンスクエンチン化溶液混合物を、メーカーの指示に従って1分間、セクションに直接塗布します。すぐにTBSTでスライドを6回、毎回10分間洗います。各スライドを300ナノモルDAPIの100マイクロリットルで暗い5分間覆います。
その後、TBSTで3分間5回洗います。アンチフェード実装メディアのドロップを、セクションの周囲のガラススライドに直接塗布します。気泡を作成せずに、カバースリップをセクションにそっと置きます。
サンプルが摂氏4度で暗闇の中で一晩治るようにします。血栓を見つけるには、10倍の目的を持つ位相コントラスト顕微鏡を用いて、大動脈、大動脈分岐および各女性動脈の長さに沿って頸部にスキャンする。まず、357ナノメートルと44ナノメートルの励起を用いてDAPIチャネルを使用して無細胞DNAのセクションを調べる。
テキサス州の赤および緑色蛍光タンパク質チャネル上で、細胞外好中球エラスターゼとシトルリン化ヒストンH3をそれぞれ同定します。ピクセルの輝度の飽和を避けるために、画像の取得を通じて各チャンネルの一貫した露出時間とゲインを維持します。好中球外細胞トラップは、好中球エラスターゼの共局在化、ヒストンH3および無細胞DNAの同局化に基づいて同定される。
ヘマトキシリンとエオシン染色、および明視野顕微鏡を使用して、ネコ動脈血栓は赤血球、白血球、フィブリンおよび血小板で構成される。NETsは、近くの赤血球と白血球を取り巻く様々な長さの深い紫色の糸のネットワークとして現れました。このプロトコルを用いて、免疫蛍光顕微鏡は、無細胞DNA、細胞外シトルリン化ヒストンH3および好中球エラスターゼからなるNETの大規模な凝集体を明らかにした。
免疫顕微鏡における位相コントラストの下で、血栓は血管空間内の十分に区分された構造として特徴付けられていた。しかし、いずれの対照試料でも血栓は検出されなかった。この図は、488ナノメートルの波長で画像化した赤血球のような血栓元素の深遠な自己蛍光を示しています。
免疫標識後の簡単な自己蛍光の急な消光は、赤血球が豊富な領域でもタンパク質共局在化およびNET検出の感度を有意に増加させた。固定の持続時間は、特定の抗原の免疫反応性に影響を及ぼす。脱水とパラフィンの埋め込み24時間以下の固定をお勧めします。
あるいは、メタノールフリーパラホルムアルデヒドを用いることで、ホルムアルデヒドの酸化によるギ酸およびケトンによる加工品を制限することができる。同じ種から発生した一次抗体を使用する際の干渉を防ぐために、我々は二次抗体上の残りの結合部位を飽和させる追加のブロッキングステップを含む。研究者は、アイソタイプ抗体、一次抗体および免疫標識ステップの排除、血栓症のない猫からの生物学的制御からなる陰性対照を含まなければならない。
血栓の組織限界の自己蛍光は、好中球の細胞外トラップの顕微鏡的同定を打ち負かすことができる。研究者は、遠赤色蛍光体を使用することにより蛍光を最小限に抑えることができます。この技術は、他の獣医種における好中球細胞外トラップの研究に貴重なツールであり得る。
これは、血栓症の病態生理学のより良い理解を提供することができます.
