生成基于人类 iPSC 的血脑屏障芯片

该协议将展示如何分化诱导多能干细胞在片上器官上播种，以产生一个完全人性化的、个性化的微流体血脑屏障，可用于预测中枢神经系统药物的渗透性，并研究神经系统疾病。使用市售的片上器官，我们将演示任何面向生物的实验室如何使用这项技术来生成个性化的微流体血脑芯片屏障。累积的证据表明，BBB通过产生源自遗传神经系统疾病个体的 iPSC 的个性化 BBB 芯片，在神经系统疾病中发挥作用。

研究BBB在健康和疾病中的作用是可能的。这种方法对制药公司也很有用，它可以使用这个人类BBB平台来筛选候选神经药物进入人脑的可接受性。在片上应用器官技术通常需要专门的工程技能。

使用市售平台可在任何面向生物的实验室中应用此技术。首先，将装有准备好的薯条的盘子带到生物安全柜。使用 P200 移液器，通过将 200 微升神经分化介质加入入口并从出口中拉出液体，轻轻清洗两个通道。

避免与端口接触，小心地从芯片表面吸入多余的介质液滴。轻轻搅拌细胞悬浮液，以确保细胞均匀悬浮液。要将 iPSC 衍生的神经祖细胞播种到顶部通道中生成大脑侧，请添加一个 P200 尖端，其中包含 30 到 100 微升细胞悬浮液，浓度为每毫升 10 倍至 6 个细胞到顶部通道入口，然后轻轻地从移液器中释放尖端。

取一个空的P200移液器，压压柱塞，插入顶部通道出口，并小心地将单细胞悬浮液拉过尖端。将芯片转移到显微镜上，检查顶部通道内细胞的种子密度和均匀分布。在确认细胞密度为20%覆盖后，立即将芯片在37摄氏度的培养箱中放置两小时。

之后，通过向入口中加入新的神经分化介质，然后通过移液器从出口中拉出液体，洗去不连接的细胞。将细胞在静态条件下保持37摄氏度，每日更换神经分化介质。在 iNPC 连接后或在播种后的第二天，将含有已准备的芯片的盘子带到生物安全柜。

用 200 微升内皮细胞介质轻轻清洗底部通道。避免与端口接触，小心地从芯片表面吸入多余的内皮细胞介质液滴，确保将介质留在两个通道中。轻轻搅拌细胞悬浮液，以确保细胞均匀悬浮液。

使用P200移液器，在浓度为14至20倍的10倍至每毫升6个细胞时，绘制30至100微升的 iPSC 衍生脑微血管内皮细胞悬浮液，然后将尖端放入底部通道入口。实现功能屏障特性的最关键步骤是脑微血管内皮细胞的播种。以适当的密度播种细胞，以避免气泡形成，以验证器官芯片内的均匀分布至关重要。

用空尖端压压 P200 移液器上的柱塞，插入底部通道出口，然后缓慢释放移液器柱塞，小心地将单单元悬架拉过底部通道。从芯片表面吸出多余的电池悬浮液。避免与进气口和出口端口直接接触，以确保没有从通道中吸气。

将芯片转移到显微镜上以检查播种密度。底部通道充满了单元格，两者之间没有可观察到的间隙。确认正确的细胞密度后，在剩余的芯片中播种细胞。

将电池连接到位于底部通道顶部的多孔膜上，反转每个芯片，让它们放在芯片底座中。将一个含有无菌 DPBS 的小储液罐放在 150 毫米的培养皿内，为细胞提供湿度。在37摄氏度下孵育芯片约3小时，或直到底部通道中的细胞附着。

一旦 iPSC 衍生的脑微血管内皮细胞连接，将芯片翻转回直立位置，使细胞附着到底部通道的底部。iPSC衍生脑微血管内皮细胞播种48小时后，在37摄氏度的水浴中加热一小时，平衡内皮细胞介质的温度。然后，在真空驱动的过滤系统下通过孵化将介质除气15分钟。

接下来，用70%乙醇对便携式模块包装和托盘的外部进行消毒，擦拭，然后转移到生物安全柜。打开包装盒，将模块放入托盘中，将模块与储液罐朝向托盘背面的方向。向每个进气储层提供三毫升预平衡的暖介质。

将内皮细胞培养介质添加到底部通道的入口储液罐中，将神经分化介质添加到顶部通道的顶部通道进储液罐中。然后，移液器300微升的预平衡，温暖的介质到每个出口储液罐，直接在每个出口端口。在每个托盘上放置多达六个便携式模块。

将托盘带到培养箱中，然后完全滑入培养模块，托盘手柄朝外。在区域性模块上选择并运行主要周期。关闭孵化器门，让培养模块为便携式模块准备约一分钟。

当状态栏读取就绪时，启动周期完成。从培养模块中取出托盘，并将其带到生物安全柜。检查生物安全柜中每个便携式模块的底面，以验证便携式模块是否已成功起底。

查找所有四个端口是否存在小液滴。如果任何便携式模块未显示液滴，请在这些模块上重新运行主要循环。如果任何介质滴到托盘上（更频繁地出现在出口端口上），请用 70% 乙醇清洁托盘。

接下来，用温暖、平衡的细胞特异性培养基轻轻清洗每个芯片的两个通道，以去除通道中任何可能的气泡，并在每个入口和出口端口的顶部放置小介质滴。将带托架的芯片插入便携式模块，并在每个托盘上放置最多 6 个。将纸盒插入培养模块。

在培养模块上编程适当的器官芯片培养条件，如流速和拉伸。一旦调节周期完成，大约需要两个小时，编程条件就开始。之后，培养模块在预设的器官芯片培养条件下开始流动。

基于 iPSC 的血脑屏障芯片上免疫细胞化学在播种后七天显示 EZ 球体分化成顶部大脑侧通道的混合神经细胞群，包括 S100 β 阳性星细胞、内丁阳性神经祖细胞以及 GFAP 阳性星细胞和 β III 图布蛋白阳性神经元。IPSC衍生的脑微血管内皮细胞在底部血侧通道中播种，表达胶质-1和PECAM-1。对血脑屏障芯片渗透性的评价表明，与仅用 iPSC 衍生脑微血管内皮细胞和 EZ 球体播种的器官芯片相比，仅用 iPSC 衍生脑微血管内皮细胞播种的器官芯片具有紧密的屏障。

单独用EZ球体播种的器官芯片没有显示任何屏障特性。从通道的初始表面处理到每天的介质切换，避免通道中形成气泡。在整个协议中，需要通过通道插入表面活化试剂、细胞外基质或含细胞介质，因此仔细验证是否未发现气泡非常重要。

可进行渗透性测定，以评估候选药物的人体大脑渗透性。这种方法可用于测试潜在的治疗方法。基于 iPSC 的 BBB 芯片的应用允许研究 BBB 在各种神经系统疾病中的作用。

将来，这种平台可能有助于预测性、个性化的医学应用。