이 프로토콜은 분화 유도 된 만능 줄기 세포가 중추 신경계 약물 투과성을 예측하고 신경 장애를 연구하는 데 사용할 수있는 완전히 인간, 개인화 된 미세 유체 혈액 - 뇌 장벽을 생성하기 위해 장기 온 칩에 시드 될 수있는 방법을 보여줍니다. 시판되는 장기 온 칩을 사용하여, 우리는 어떤 생물학적 지향적인 실험실이 개인화된, 미세 유체 혈액-뇌 장벽-온 칩을 생성하기 위해 이 기술을 어떻게 사용할 수 있는지 를 보여줍니다. 증거를 축적하는 것은 BBB가 유전 신경 질환을 가진 개별의 iPSCs에서 파생된 개인화된 BBB 칩을 생성해서 신경학상 질병에 있는 역할을 한다는 것을 건의합니다.
건강과 질병에 있는 BBB의 역할을 공부하는 것이 가능할 것입니다. 이 방법은 또한 제약 회사에 유용 할 수 있습니다, 이는 인간의 뇌에 후보 신경 약물의 침투성을 선별하기 위해이 인간의 BBB 플랫폼을 사용할 수 있습니다. 장기 온 칩 기술의 적용에는 일반적으로 특수 엔지니어링 기술이 필요합니다.
상업적으로 이용 가능한 플랫폼을 사용하면 생물학적 지향 실험실에서 이 기술을 사용할 수 있습니다. 먼저 준비된 칩이 들어 있는 접시를 생물안전 캐비닛에 가져오십시오. P200 파이펫을 사용하여 200 마이크로리터의 신경 분화 매체를 입구에 추가하고 콘센트에서 액체를 당겨 두 채널을 부드럽게 세척하십시오.
포트와의 접촉을 피하고 칩 표면에서 과도한 미디어 물방울을 조심스럽게 흡인시합니다. 균일한 세포 현탁액을 보장하기 위해 셀 현탁액을 부드럽게 교반합니다. iPSC 유래 신경 전구세포를 상부 채널에 시드하여 뇌 측을 생성하려면, 상단 채널 입구에 밀리리터당 6개의 세포에 10~6개의 세포에 10~100마이크로리터의 농도로 세포 현탁액30 내지 100 마이크로리터를 포함하는 P200 팁을 추가하고, 파이펫으로부터 팁을 부드럽게 풀어놓는다.
빈 P200 파이펫을 가지고 플런저를 누르고, 상단 채널 콘센트에 삽입하고, 팁을 통해 단일 셀 서스펜션을 조심스럽게 당깁니다. 칩을 현미경으로 전송하여 톱 채널 내의 세포의 파종 밀도 및 균질분포를 확인합니다. 세포 밀도를 20% 커버리지로 확인한 후 즉시 칩을 섭씨 37도에서 2시간 동안 인큐베이터에 넣습니다.
그 후, 입구에 신선한 신경 분화 매체를 추가하고 콘센트에서 파이펫을 통해 액체를 당겨 부착하지 않는 세포를 씻어. 매일 신경 분화 매체 교체와 함께 37섭씨에서 세포를 유지합니다. iNPC가 부착한 후 또는 파종 후 다음 날에 준비된 칩이 들어 있는 접시를 생물 안전 캐비닛에 가져온다.
내피 세포 배지 200 마이크로리터로 바닥 채널을 부드럽게 세척합니다. 포트와의 접촉을 피하고 칩 표면에서 과도한 내피 세포 매체의 물방울을 조심스럽게 흡인하여 두 채널모두에 배지를 두십시오. 균일한 세포 현탁액을 보장하기 위해 셀 현탁액을 부드럽게 교반합니다.
P200 파이펫을 사용하여, iPSC 유래 뇌 미생물 내피 세포 현탁액의 30~ 100 마이크로리터를 밀리리터당 6개의 세포에 14-20배 10배의 농도로 끌어내고, 팁을 바닥 채널 입구에 놓는다. 기능 장벽 특성을 달성하기 위한 가장 중요한 단계는 뇌 미세 혈관 내피 세포의 파종입니다. 장기 칩 내의 균일 한 분포를 확인하기 위해 거품 형성을 피하기 위해 적절한 밀도로 세포를 종자 하는 것이 중요합니다.
빈 팁으로 P200 파이펫의 플런저를 누르고, 하단 채널 콘센트에 삽입하고, 천천히 파이펫 플런저를 방출하여 하단 채널을 통해 단일 셀 서스펜션을 조심스럽게 당깁니다. 칩 표면에서 과도한 셀 서스펜션을 흡인시합니다. 인렛 및 콘센트 포트와의 직접 접촉을 방지하여 셀 서스펜션이 채널에서 흡습되지 않도록 하십시오.
칩을 현미경으로 전송하여 파종 밀도를 확인합니다. 하단 채널은 사이에 관찰 가능한 간격이 없는 셀로 채워져 있습니다. 올바른 세포 밀도를 확인한 후 나머지 칩에 셀을 시드합니다.
하단 채널 위에 있는 다공성 막에 세포를 부착하려면 각 칩을 반전시키고 칩 요람에 놓습니다. 150mm 접시 안에 멸균 DPBS를 함유한 작은 저수지를 배치하여 세포에 습도를 제공합니다. 칩을 섭씨 37도에서 약 3시간 동안 또는 하단 채널의 세포가 부착될 때까지 배양합니다.
iPSC 유래 뇌 미생물 내피 세포가 부착되면 칩을 똑바로 똑바로 세워 하단 채널의 하단 부분에 세포 부착을 허용합니다. iPSC 유래 뇌 미생물 내피 세포의 48시간 후 시축은 내피 세포 중의 온도를 1시간 동안 섭씨 37도에서 따뜻하게 하여 평형화한다. 그런 다음 진공 구동 여과 시스템 하에서 배양하여 배지를 15분 동안 분해합니다.
다음으로 휴대용 모듈 포장 및 트레이의 외관을 70%에탄올로 소독하고 닦아 생물안전 캐비닛으로 옮길 수 있습니다. 패키지를 열고 모듈을 트레이 의 뒤쪽쪽으로 저장소로 오리엔트에 넣습니다. 각 입구 저수지에 미리 평형되고 따뜻한 매체의 파이펫 3 밀리리터.
내피 세포 배양 배지를 상부 채널의 상부 채널 입구 저장소에 하단 채널 및 신경 분화 매체의 입구 저장소에 추가합니다. 그런 다음, 각 콘센트 저장소에 미리 평형되고 따뜻한 매체의 파이펫 300 마이크로리터가 각 콘센트 포트 바로 위에 있습니다. 각 트레이에 최대 6개의 휴대용 모듈을 배치합니다.
트레이를 인큐베이터에 가져오고 트레이 핸들이 바깥쪽을 향하여 배양 모듈에 완전히 밀어 넣습니다. 배양 모듈에서 프라임 사이클을 선택하고 실행합니다. 인큐베이터 도어를 닫고 배양 모듈이 휴대용 모듈을 약 1분 동안 프라임할 수 있도록 합니다.
상태 표시줄이 준비된 경우 프라이밍 주기가 완료됩니다. 배양 모듈에서 트레이를 제거하고 생물 안전 캐비닛에 가져옵니다. 생체 안전 캐비닛의 각 휴대용 모듈의 아래쪽을 검사하여 휴대용 모듈이 성공적으로 준비되었는지 확인합니다.
네 개의 포트에서 작은 물방울이 있는 것을 찾습니다. 휴대용 모듈에 물방울이 표시되지 않으면 해당 모듈에서 프라임 사이클을 다시 실행합니다. 콘센트 포트에서 더 자주 발생하는 용지에 용지가 떨어지면 트레이를 70%에탄올로 청소하십시오.
다음으로 각 칩의 두 채널을 따뜻하고 평형된 세포 별 배양 배지로 부드럽게 세척하여 채널의 가능한 거품을 제거하고 각 입구및 콘센트 포트 의 상단에 작은 미디어 방울을 놓습니다. 휴대용 모듈에 캐리어가 있는 칩을 삽입하고 각 트레이에 최대 6개를 배치합니다. 트레이를 배양 모듈에 삽입합니다.
배양 모듈에 유량 및 스트레치와 같은 적절한 장기 칩 배양 조건을 프로그래밍합니다. 약 2시간이 걸리는 조절 주기가 완료되면 프로그래밍된 조건이 시작됩니다. 그 후, 배양 모듈은 사전 설정된 장기 칩 배양 조건에서 흐름을 시작합니다.
iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩에 면역 세포 화학 7 일 후 종자 후 S100 베타 양성 성상 세포, 네신 양성 신경 전구 세포뿐만 아니라 GFAP 양성 성구 세포, 베타 III 투덜인 양성 뉴런을 포함하여 상위 뇌 측 채널에서 혼합 신경 세포 집단으로 분화 된 EZ 구체를 보여줍니다. IPSC 유래 뇌 미생물 내피 세포는 바닥 혈액 측 채널에서 시드GLUT-1 및 PECAM-1을 발현시켰다. 혈액-뇌 장벽 칩 투과성의 평가는 iPSC 유래 뇌 미생물 내피 세포와 EZ 구체로 시드된 장기 칩이 iPSC 유래 뇌 미생물 내피 세포로 시드된 장기 칩에 비해 단단한 장벽을 가졌다는 것을 보여준다.
EZ 구체만으로 시드된 오르간 칩은 장벽 특성을 표시하지 않았습니다. 채널의 초기 표면 처리부터 매일 중간 스위칭까지 채널의 버블 형성을 피하십시오. 표면 활성화 시약, 세포외 매트릭스 또는 세포 함유 매체가 채널을 통해 삽입되어야 하는 프로토콜의 단계 전반에 걸쳐, 거품이 발견되지 않았는지 신중하게 확인하는 것이 매우 중요합니다.
투과성 분석은 후보 약물의 인간의 뇌 침투성을 평가하기 위해 수행 될 수있다. 이 접근은 잠재적인 치료치료를 시험하기 위해 봉사할 수 있습니다. iPSC 기반 BBB 칩의 적용은 다양한 신경 질환에서 BBB의 역할을 연구 할 수 있습니다.
미래에 이러한 플랫폼은 예측, 개인화 된 의학 응용 프로그램에 유용 할 수 있습니다.
