CXCR4在Murine B-1a细胞上的逆转录病毒过度表达和靶向B-1a细胞向骨髓和IgM生产转移的采用转移

该协议可以评估靶向基因传递如何影响B-1a细胞的定位和功能，并可以作为研究体内基因治疗潜力的概念验证方法。这种方法为原发性B-1a细胞提供了稳定且相对有效的基因传递，并允许识别供体细胞表型和功能后收养转移。该方法可用于检查体内不同的供体和宿主细胞过程，包括细胞存活、增殖和功能，并可应用于其他采用性转移系统。

永久液体的收获可能比较棘手。一定要彻底脱离细胞，以最大限度地提高恢复，并避免刺穿肠道，可以污染你的性细胞群体。对于腹膜B-1细胞的收集，使用直手术剪刀在腹部做一个表面切割的12至14周大，男性，CD45.1+阿波利波蛋白E敲除小鼠，并使用弯曲的剪刀剥回皮肤，露出腹膜壁。

使用配备 25 量针的 10 毫升注射器，用 10 毫升 37 摄氏度 RPMI-1640 介质冲洗腹腔。并抓住尾巴的底座，让鼠标从一侧完全摇动到另一侧15至20秒。摇动后，使用注射器从臀部水平正上方的右下侧吸出液体，靠近肠道，注意避免破坏表皮脂肪库和基础器官。

收集六到七毫升的熔岩后，将液体放入冰上50毫升的锥形管中。使用钳子抓住隔膜上方的腹膜壁，使动物垂直升高，使任何剩余的液体留在腹膜腔的底部。使用手术剪刀在肝脏上方的内皮内壁上做一个小切口，而不切割肝脏本身。

并使用玻璃移液器和灯泡收集任何剩余的内层液体。收集完所有液体后，将所有小鼠的内酮洗净细胞等为一体，并在50毫升的冰管中，将每管浓度的10至第八细胞添加1倍至第八个细胞。通过离心沉淀细胞。

将每粒颗粒重新用一毫升的抗CD16/CD32抗体在检测缓冲液中以1比50的比例稀释，在4摄氏度下孵育10分钟。在孵育结束时，将同等体积的生物素化抗体主混合添加到每个管中，在4摄氏度下孵育20分钟，然后在每管5毫升的测定缓冲液中清洗。根据细胞浓度和制造商的建议，用适当体积的抗生物素微珠和适当的孵化持续时间重新填充颗粒，然后每管洗5毫升测定缓冲液。

将每个颗粒重新悬浮在 500 微升的测定缓冲液中，并用每柱三毫升的测定缓冲液填充适当数量的磁性选择柱。将细胞转移到底向柱上，在15毫升的圆锥管中收集含有丰富B-1细胞的埃卢特。然后用额外的测定缓冲液清洗每个磁性选择柱，直到总收集的体积为10毫升，并在B细胞培养基中每毫升浓度的10倍将净化后细胞分数重新悬浮到第六细胞。

刺激内胸乙基细胞至少留出1倍10到第七细胞进行非转导控制，将剩余的细胞分成两个相等的体积进行转导。稀释细胞至1.5倍至5细胞每150微升的中等浓度，并添加150微升细胞到一个96孔圆底板的井中，以进行转导。然后在每孔中加入100个TLR9激动剂纳米摩尔，并将板放在细胞培养培养箱中16至18小时。

用于逆转性转导的内粒B细胞解冻磷酸钙转染逆转录病毒颗粒物在冰上，并立即添加到控制和化疗受体逆转录病毒超级杀菌剂到适当的板的每个井和多重感染20至1在存在8微克每毫升多聚苯乙烯和新鲜的β-汞醇在55微摩尔最终浓度。当所有病毒被添加后，通过离心使细胞旋转，并在细胞培养箱中放置板三个小时。在孵育结束时，收获细胞，在新鲜的B细胞培养基中重新育制，并隔夜孵育。

与其他内膜细胞类型的磁耗后，与F4/80+巨噬细胞相比，消耗后部分的活单细胞具有更大的CD19+B细胞比例，并且缺乏CD5hi CD19-T细胞，并且它们含有比消耗前分数更高的CD19+CD5中等B-1a细胞的频率。成功转导的GGFP+B-2、B-1、B-1a和B-1b细胞子集的频率增加与感染病毒多样性的增加直接相关。与使用 24 孔或 6 孔板相比，使用 96 孔圆底板可进一步提高转导效率。

CXCR4-GFP逆转录病毒转导可诱导成功的B-1细胞CXCR4过度表达，并增加体外向CXCL12的迁移，而不会对B细胞的生存能力产生重大影响。此外，在细胞转移后17周从CD45.2受接受小鼠的骨髓和脾殖中恢复后，采用移植CD45.1+供体细胞维持其CXCR4过度表达。值得注意的是，CXCR4表达和供体细胞定位到骨髓而不是脾脏之间的正关联已经确定。

骨髓中供体细胞数与抗MDA低密度脂蛋白IgM的血浆量之间观察到正关联。许多额外的技术可用于回答诸如目标基因传递对疾病发展的影响，或者哪些捐赠者获得影响宿主生理学的分泌因素。